CRISPR是成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的缩写，指存在于许多细菌和古菌中的一类脱氧核糖核酸序列。这些序列包含重复片段，片段之间由各不相同的“间隔序列”隔开，其中一些间隔序列源自入侵的遗传物质。它们与CRISPR相关（Cas）蛋白质共同构成具有序列特异性的防御系统。在生物技术领域，“CRISPR”也常指由这一机制改造而来的工具，尤其是用于基因组编辑的RNA引导系统。重复序列阵列、天然防御系统和人工改造的工具彼此相关，但属于不同概念。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
天然结构与功能
CRISPR阵列是一段DNA，其中相似的短重复序列与各不相同的间隔序列交替排列。附近的 cas 基因通常编码参与间隔序列获取、RNA加工或外源遗传物质识别的蛋白质。同一阵列内的重复序列相对保守，而其识别特异性主要由间隔序列决定。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
天然CRISPR防御通常分为三个阶段。在适应阶段，入侵遗传物质的片段被纳入阵列，成为新的间隔序列。在表达与加工阶段，转录（生物学）产生RNA前体，随后被加工为CRISPR RNA，简称crRNA。在干扰阶段，这些RNA引导Cas分子机制识别与其匹配的外源序列，使其被切割或失活。实验表明，添加或删除特定间隔序列会改变细菌对相应噬菌体的抵抗能力；噬菌体是感染细菌的病毒。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
这构成了一种适应性免疫：先前遭遇入侵时获得的序列信息可用于后续防御。其分子机制不同于脊椎动物以抗体和淋巴细胞为基础的免疫系统。CRISPR系统具有多样性；基于Cas9的DNA靶向机制只是其中一例，并非所有系统共有的机制。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
作为研究工具的发展
CRISPR这一术语由2002年的一项研究提出，该研究还鉴定了相关的 cas 基因。2007年，在嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）中开展的实验直接证明，获取源自病毒的间隔序列能够使细菌获得对这些病毒的抵抗能力。这些发现确立了重复序列与间隔序列交替排列这一结构的生物学功能。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
2012年，马丁·伊内克及其同事，包括詹妮弗·杜德纳和埃玛纽埃勒·沙尔庞捷，在纯化体系中证明了Cas9能够实现可编程的DNA切割。他们还将其两个天然RNA组分合并，设计出单向导RNA。2013年，研究人员在人类细胞中实现了由Cas9介导的靶向编辑，推动CRISPR成为一种实验技术。杜德纳和沙尔庞捷因开发基因组编辑方法而获得2020年诺贝尔化学奖。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
CRISPR–Cas9编辑的工作原理
在一种广泛使用的配置中，Cas9与向导RNA结合，该RNA含有与预定DNA位点互补的靶向序列。识别过程还要求附近存在原间隔序列邻近基序，简称PAM。Cas9先在DNA上寻找合适的PAM，再检验DNA与向导RNA是否互补。它的两个切割结构域分别切断DNA的两条链，造成双链断裂。因此，靶向识别既取决于向导RNA与DNA的配对，也取决于酶本身的识别要求。(nature.com)
最终的编辑结果取决于细胞的DNA修复过程，而不只是切割本身。末端连接途径可能引入小片段插入或缺失，有时会破坏基因功能。若提供合适的修复模板，同源定向修复可以引入指定的替换或插入。两种途径都不能保证只产生一种预期结果；编辑效率及产物分布会随靶点和细胞环境而变化。(nature.com)
与早期可编程核酸酶相比，一个重要的实际差别在于：改变靶点通常只需更换向导RNA，而不必构建新的DNA结合蛋白。因此，CRISPR便于研究多个基因组位点，也便于开展同时扰动多个基因的实验。(genome.gov)
相关CRISPR技术
其他Cas酶拓展了可利用的作用机制。Cas12a最初称为Cpf1，是一种由单个RNA引导、能够切割DNA的酶，其靶向要求和切割特性与Cas9不同。Cas13a靶向RNA而非DNA，在识别靶标后还能切割其他RNA分子；这一特性已被用于分子检测。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)
由CRISPR衍生的工具不一定需要造成双链断裂：
- **CRISPR干扰**利用失去催化活性的Cas9结合DNA并阻碍转录，而不切割靶序列。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
- **碱基编辑**将靶向蛋白与化学修饰机制相结合。已有的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器能够转换特定碱基对，而无需造成双链断裂。(nature.com)
- **先导编辑**结合了Cas9切口酶、逆转录酶，以及编码预期改动的延长向导RNA。它无需供体DNA模板，即可引入替换和小片段插入或缺失。(nature.com)
这些技术的靶向限制和可能产生的副产物各不相同，并不是同一种编辑反应的可互换版本。(nature.com)
应用与局限
CRISPR使研究人员能够通过破坏基因、改变特定序列和降低基因表达来研究生物学功能。其靶向RNA的机制也可用于检测：SHERLOCK平台将Cas13a由靶标触发的RNA切割与核酸扩增相结合，产生可测量的信号。这类检测无需编辑患者的基因组。(nature.com)
2023年12月8日出现了一项临床里程碑：美国食品药品监督管理局（FDA）批准Casgevy用于符合条件、年龄在12岁及以上且反复发生血管闭塞危象的镰状细胞病患者。这是首款获得FDA批准的CRISPR–Cas9疗法。该疗法在体外编辑患者的造血干细胞和祖细胞，破坏与 BCL11A 相关的一个调控区域，以增加胎儿血红蛋白的生成。它并不直接纠正导致镰状细胞病的突变。(fda.gov)
其局限包括在其他基因组位点产生非预期变化、编辑不完全，以及难以将编辑工具递送至所需细胞。当只有部分细胞携带某项编辑时，就会出现嵌合现象。在人类应用中，还需区分作用于接受治疗的体细胞的体细胞编辑，以及可能产生可遗传变化的生殖系编辑。后者会引发额外问题，涉及安全性、知情同意及对后代的影响。(genome.gov)