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科学 / 生物 / cas-nine

Cas9

Cas9 是一种由 RNA 引导的 DNA 核酸酶，源自细菌 CRISPR 系统，广泛用于基因组编辑和基因表达的可编程调控。

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Cas9 是一种由 RNA 引导的 酶，可在向导RNA指定的序列及其相邻识别基序处切割 DNA。它是 II 型 CRISPR–Cas 系统的主要干扰蛋白；这类系统为 细菌提供针对外来遗传物质的序列特异性防御。经过改造以用于实验室后，Cas9 可通过制造靶向 DNA 断裂来实现 基因组编辑，而细胞对断裂的修复可能改变 DNA 序列。工程化变体还可作为可编程 DNA 结合蛋白，或用作无需造成双链断裂的编辑系统的组成部分。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

生物学起源与功能

CRISPR 系统会将先前遇到的外来 DNA 片段储存为 间隔序列，并将它们插入细菌 基因组中的重复序列之间。由这些阵列转录产生的 RNA 提供序列信息，用于识别相应的遗传物质，包括来自 噬菌体和 质粒的 DNA。在 II 型系统中，Cas9 利用这些信息识别并切割入侵的 DNA 分子。这是一种微生物适应性防御，与脊椎动物的细胞免疫机制不同。(nobelprize.org)

天然 Cas9 的靶向依赖两种 RNA 组分：

  • CRISPR RNA（crRNA） 含有源自间隔序列的序列，与靶 DNA 互补。
  • 反式激活 CRISPR RNA（tracrRNA） 与 crRNA 的一部分配对，并提供 Cas9 结合及 DNA 切割所需的结构。

在基因组工程中，这两种组分可以融合为一条 单链向导RNA（sgRNA）。在保留与 Cas9 结合的支架结构的同时，可以更改其靶向片段。因此，改变 RNA 序列，就能将同一种蛋白质引导到另一个兼容的 DNA 位点。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

结构与靶标识别

研究最充分的形式是来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的 Cas9，通常称为 SpCas9。它由 1,368 个 氨基酸组成，具有双叶结构：一叶为识别叶，与向导 RNA–靶标复合物相互作用；另一叶为核酸酶叶，含有催化机制以及参与识别相邻 DNA 基序的区域。结构研究揭示了向导 RNA 和靶 DNA 如何嵌入这一结构。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

原间隔序列邻近基序

Cas9 识别靶标并非只依赖 RNA–DNA 互补配对。它还要求靶序列（即 原间隔序列）旁存在合适的 原间隔序列邻近基序（PAM）。对于常规 SpCas9，主要的 PAM 是 5′-NGG-3′5^{\prime}\text{-NGG-}3^{\prime}，其中 NN 表示任意一种核苷酸。向导 RNA 通常指定一段约 20 个 核苷酸长的序列。PAM 是 DNA 底物的一部分，而不是与向导 RNA 配对的序列的一部分。(nature.com)

Cas9–RNA 复合物首先会在 DNA 上寻找兼容的 PAM。识别 PAM 会促进局部 DNA 解链，使向导 RNA 能够检验其邻近序列。随后，RNA–DNA 配对从靠近 PAM 的区域开始延伸。因此，对于常规 SpCas9，即使序列完全互补，若附近没有合适的 PAM，也不能视为有效靶标。(nature.com)

R 环形成与切割

向导 RNA 与靶序列配对后会形成 R 环：其中 RNA 与 DNA 形成杂交链，同时另一条 DNA 链被置换。与向导 RNA 互补的链通常称为 靶链；被置换的链称为 非靶链。Cas9 含有两个催化结构域：

  • HNH 结构域切割靶链。
  • RuvC 结构域切割非靶链。

对于 SpCas9，切割通常发生在 PAM 上游约三个碱基对处。两条链均被切开后，会形成双链断裂。靶标识别还涉及构象检查点：与某段 DNA 序列结合，并不意味着酶一定会完成切割。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

基因组编辑与 DNA 修复

Cas9 造成靶向损伤，但本身不会写入任意的替代序列。最终产生何种编辑，取决于 DNA修复途径、靶序列、细胞环境以及是否提供修复模板。这一区别体现了靶向精度（酶作用的位置）与编辑精度（最终保留下来的 DNA 序列）并非一回事。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

末端连接

非同源末端连接及其他相关末端连接途径会修复断裂的 DNA 末端。修复可能恢复原始序列，也可能产生插入和缺失，通常统称为 indel。如果这些变化发生在编码区，某些 indel 会破坏阅读框或以其他方式损害 基因，因此 Cas9 可用于基因敲除实验。不过，发生切割并不保证基因功能会丧失：不同的修复产物可能保留活性或造成部分改变。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

模板指导的编辑

涉及 同源重组的修复过程可以利用提供的 DNA 模板引入特定序列变化，从而在选定基因座进行靶向替换、插入或序列整合。模板指导的编辑会与其他修复结果竞争，因此即使同时提供靶向断裂和修复模板，也不能确保每个处理过的细胞都获得预期编辑。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

使用多条向导 RNA 可将 Cas9 引导至多个位点。这使研究者能够同时扰动不同基因，或删除两个切割位点之间的区域。不过，当多个 DNA 断裂同时存在时，多重靶向也会增加出现非预期结果的可能性。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

天然形式与工程化变体

Cas9 指的是一组相关蛋白，而非单一的通用序列。 不同细菌来源的 Cas9 在大小、向导 RNA 要求和 PAM 识别方面各不相同。例如，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Cas9（SaCas9）比 SpCas9 小，靶向要求也不同。在实验研究中，它较小的编码序列便于将 Cas9 和向导 RNA 表达盒一同包装进单个腺相关病毒载体。(nature.com)

一些工程化形式具有不同的功能：

  • Cas9 切口酶的一种催化结构域失活，只切割一条 DNA 链。它们可用于成对切口策略，或作为其他编辑系统的组成部分。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)
  • 催化失活的 Cas9 通常称为 dCas9，其两种核酸酶活性均已失活，但仍保留由 RNA 引导的 DNA 结合能力。它可以阻碍转录而不切割 DNA。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)
  • 高保真 Cas9 变体通过改变相互作用或构象检查点，减少对匹配不完全的靶标进行切割。SpCas9-HF1 和 HypaCas9 就是其中的例子。相关特异性改进是在经过测试的向导 RNA、细胞系统和实验中报告的；这并不意味着在所有条件下都不可能发生脱靶活性。(nature.com)

碱基编辑与先导编辑

碱基编辑器将源自 Cas9 的靶向模块与一种可通过化学方式改变 DNA 碱基的酶结合。已建立的系统包括可实现 C ⁣⋅ ⁣G→T ⁣⋅ ⁣AC\!\cdot\!G \rightarrow T\!\cdot\!A 转换的胞嘧啶编辑器，以及可实现 A ⁣⋅ ⁣T→G ⁣⋅ ⁣CA\!\cdot\!T \rightarrow G\!\cdot\!C 转换的腺嘌呤编辑器。这些系统无需造成靶向双链断裂，即可引入选定的碱基替换。化学转换由连接的编辑酶完成，而非 Cas9 本身。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

先导编辑将 Cas9 切口酶与逆转录酶，以及一条编码预期编辑内容的延伸向导 RNA 结合。该系统将 RNA 中的信息复制到 DNA 中，无需单独提供供体 DNA 模板或造成靶向双链断裂，即可引入碱基替换以及小片段插入或缺失。其机制不同于常规的 Cas9 切割与修复编辑，也不同于碱基编辑。(nature.com)

应用

Cas9 可用于在哺乳动物细胞中实验性地破坏基因、引入特定遗传变化，以及删除选定的基因组区域。由于其靶向依靠 RNA 指定，而不必为每个基因座重新设计 DNA 结合蛋白，因此也适用于同时研究多个遗传元件的多重实验。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

核酸酶失活的 Cas9 将这一技术平台扩展到永久改变序列之外。CRISPR干扰（CRISPRi）利用 dCas9 介导的靶向来抑制 基因表达，例如阻碍转录起始或延伸。研究者因此能够探究表达量降低的影响，而不一定改变底层 DNA 序列。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

临床应用之一是 exagamglogene autotemcel，商品名为 Casgevy。2023 年 12 月 8 日，它成为美国食品药品监督管理局批准的首种 CRISPR–Cas9 疗法，适用于符合条件的 12 岁及以上 镰状细胞病患者。该产品由患者自身在体外编辑的造血干细胞和祖细胞组成。编辑会破坏 BCL11A 的红系特异性调控区域，从而提高胎儿型 血红蛋白的生成，而不是直接纠正 HBB 中与镰状细胞病相关的序列。(content.govdelivery.com)

局限性与非预期结果

脱靶切割是指 Cas9 在预期靶标以外的位点发挥作用。某些存在不完全匹配的序列仍可能发生切割，因此，仅凭向导 RNA 的互补性并不能绝对保证特异性。在经过测试的系统中，工程化高保真蛋白可显著降低这种活性，但特异性仍取决于蛋白质、向导 RNA、靶标环境和实验条件的共同作用。(nature.com)

非预期的靶向位点变化是另一类问题。即使在正确位置发生切割，后续也可能产生大段缺失或复杂重排，而非预期的小幅变化。实验小鼠和人类细胞系统中都观察到了这类结果。因此，如果只检查切割位点周围的一小段序列，可能会漏掉延伸到该区域之外的变化。(nature.com)

递送限制会影响足量编辑机制能否进入目标细胞。SpCas9 体积较大，对某些病毒递送系统尤其构成限制；较小的 Cas9 蛋白可缓解但无法彻底消除此类限制。(nature.com)

避免造成双链断裂并不能消除所有非预期编辑来源。某些碱基编辑器会因其脱氨酶组分而导致 RNA 脱靶改变。因此，必须从机制上区分源自 Cas9 的编辑平台：核酸酶、DNA 结合调控蛋白、碱基编辑器和先导编辑器所涉及的风险并不相同。(nature.com)

历史发展

2012 年，Martin Jinek 及其同事证明，可以利用 crRNA 和 tracrRNA 对 Cas9 进行编程，使其实现序列特异性 DNA 切割；两种 RNA 还可以连接成一条工程化的单链向导 RNA。这为 RNA 可编程的基因组编辑奠定了生化基础。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

2013 年，包括 Le Cong 及其同事在内的研究者展示了 Cas9 引导的哺乳动物细胞基因组工程。同年，Lei Qi 及其同事利用催化失活的 Cas9 建立了 CRISPRi，表明可将可编程 DNA 识别与切割功能分离。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

此后的进展包括 2014 年对 Cas9–向导 RNA–DNA 复合物的结构表征、2016 年胞嘧啶碱基编辑的开发、2017 年腺嘌呤碱基编辑的开发，以及 2019 年先导编辑的开发。2020 年，Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因开发基因组编辑方法而获得 诺贝尔化学奖。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

参考来源

  1. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunitypubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  2. The Nobel Prize in Chemistry 2020 — Scientific Backgroundnobelprize.org
  3. Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNApmc.ncbi.nlm.nih.gov
  4. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9nature.com
  5. Conformational control of DNA target cleavage by CRISPR–Cas9nature.com
  6. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systemspmc.ncbi.nlm.nih.gov
  7. CRISPR/Cas9 targeting events cause complex deletions and insertions at 17 sites in the mouse genomenature.com
  8. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9nature.com
  9. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expressionpubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  10. High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effectsnature.com
  11. Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracynature.com
  12. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavagepubmed.ncbi.nlm.nih.gov