人类基因组计划

人类基因组计划（Human Genome Project，简称 HGP）是一项于 1990 年 10 月至 2003 年 4 月开展的国际科学研究计划，旨在绘制并测定人类基因组的序列。其核心成就是获得了首个人类脱氧核糖核酸参考序列，为定位基因及研究其结构组织提供了通用框架。该计划更广泛的目标还包括对模式生物进行测序、改进DNA测序技术，以及探讨基因组研究所涉及的伦理、法律和社会影响。(genome.gov)

该计划结合了大规模实验室研究、计算分析与国际协作，并迅速向公众公开发布测序数据。其参考序列并非代表单个个体或全人类的遗传多样性，而是由多位匿名捐献者的样本组装而成。尽管该计划在 2003 年达到了预定的完成标准，但序列中一些难度较高、高度重复的区域仍未被完全解析。随后的研究进一步完善了该参考序列，填补了这些空白，并开发了表征人类基因组间变异的方法。人类基因组计划不仅为遗传学和生物医学研究奠定了基石性资源，还将数据共享及负责任地使用遗传信息确立为基因组学的核心关切。(genome.gov)

科学目标与范围

人类基因组计划确立了三项互为补充的核心任务。遗传图谱绘制利用家系中的遗传规律来确定标记在染色体上的相对位置：位置相近的标记由于较少被重组分开，因而倾向于一同遗传。这种遗传连锁图谱以厘摩而非 DNA 碱基数量来度量距离。物理图谱绘制确定了 DNA 标记的排列顺序与实际物理间距，包括各重叠克隆片段之间的相互关系。DNA 测序则测定 A、C、G、T 四种核苷酸碱基的实际排列顺序。遗传图谱为定位遗传性状提供了全染色体尺度的框架；物理图谱将该框架与可获取的实际 DNA 片段相连接；测序则提供了最高分辨率的详尽描述。这些资源相辅相成，共同支撑起人类有序参考序列的构建与校验。(genome.gov)

美国国立卫生研究院与美国能源部于 1990 年联合发布了针对 1991 至 1995 财年的初始规划，重点在于构建最终进行全基因组测序所需的资源。其五年目标包括：绘制标记平均间距为 2–5 厘摩的连贯遗传图谱；构建平均约每 10 万个碱基对设有一个序列标签位点的物理图谱；以及获得在约 200 万个碱基对区域内连续延伸的重叠克隆 DNA。序列标签位点是简短、易于识别的 DNA 序列，可作为各实验室通用的参考地标。测序方面的目标包括在大跨度连续区段中累计获得 1000 万个碱基的人类 DNA 序列，并开发出能以每碱基对 0.50 美元的成本进行大规模测序的技术。这些都是阶段性里程碑，而非承诺在最初五年内完成整个人类基因组的测序。(genome.gov)

弗朗西斯·柯林斯与戴维·加拉斯于 1993 年公布了修订版规划，涵盖 1994 至 1998 财年。该规划保留了图谱绘制的目标，同时更加侧重规模化产出测序以及基因识别方法。其提出的目标是在该时期结束时达到每年 5000 万个碱基的测序通量，测序对象涵盖人类及模式生物的 DNA。技术开发旨在贯通从 DNA 模板制备到结果分析的完整流程，而非仅仅改进单个实验步骤。该规划还明确提出了建立可公开访问的数据库、数据交换标准、基因组信息比对与解读软件，以及跨学科科研人才培养等要求。模式生物的比较图谱绘制与测序也是该计划并行的重要组成部分。(doe-humangenomeproject.ornl.gov)

涵盖 1999 至 2003 财年的 1998 年规划将首要任务调整为：在 2003 年底前完成一份高质量、公开可用的人类序列，比原定预期提前了两年。该规划明确区分了“工作草图”与“完成序列”，并设立了中期目标，即在 2001 年底前完成基因组约三分之一区域的最终测序，并产出剩余部分的工作草图。配套的技术指标包括达到每年 5 亿个已完成碱基的测序通量，且成本不超过每碱基 0.25 美元。人类序列的变异也成为一项明确的目标：计划识别并定位至少 10 万个单核苷酸多态性位点，以此作为研究不同基因组间差异的标记，而不仅限于构建单一的参考序列。(genome.gov)

尽管如此，该项目的研究范围依然将基础资源的产出与全面的生物学机制解析区分开来。1998 年规划支持了全长互补 DNA 文库的构建以及用于功能研究的基因组级技术，但并不要求通过实验测定每一个基因的具体功能。同样，构建出参考序列和初步的变异图谱，并不等同于收录了全部人类遗传多样性或阐明了所有疾病。规划明确指出，解读基因组序列需要额外的比较序列、人类变异数据以及更深入的分析工作；参考序列是开展这些探索的基石，而非这些研究的终点。(genome.gov)

起源与确立

人类基因组计划的技术基础源于20世纪70年代及80年代初开发的方法。重组DNA技术使研究人员能够切割DNA、将片段连接到克隆载体上并在宿主细胞中扩增，从而让特定的基因组区域可以用于反复研究。1977年，弗雷德里克·桑格、史蒂文·尼克伦与艾伦·库尔森推出了双脱氧链终止法DNA测序：核苷酸类似物会在特定碱基处终止DNA合成，产生不同长度的片段，经电泳分离后即可读出碱基序列。1986年，劳埃德·史密斯、勒罗伊·胡德及其同事展示了基于荧光的自动化测序分析技术，利用不同标记的引物和光学检测来区分碱基。这降低了对人工判读放射性测序凝胶的依赖，并为迈向更高通量的测序铺平了道路。(genome.gov)

另一项互补的进展是用于全基因组作图的DNA标记技术的开发。1980年，戴维·博茨坦、雷蒙德·怀特、马克·斯科尔尼克和罗纳德·戴维斯提议利用限制性片段长度多态性（RFLP）构建人类遗传连锁图谱。这些经酶切产生的DNA片段长度差异具有遗传性，可以在家系中追踪。它们与遗传性状的关联使得研究人员即便在事先不了解某种疾病相关基因的生化产物的情况下，也能定位该基因。这项提议将DNA变异本身作为分布在全基因组的标记位点，而不再局限于对已有可识别表型效应的基因进行作图。(njc.rockefeller.edu)

协调开展人类基因组研究的构想在20世纪80年代中期逐渐成形。1984年12月，由美国能源部（DOE）和国际环境诱变剂与致癌剂保护委员会在犹他州阿尔塔联合举办的一次会议，探讨了重组DNA技术日益增长的作用。1985年5月，加州大学圣克鲁兹分校校长罗伯特·辛斯海默专门召集了一次关于人类基因组测序的研讨会。随后，美国能源部于1986年3月在圣菲举办了一场基因组测序研讨会；能源部的参与源自该机构长期以来对辐射暴露遗传效应的研究兴趣。在1986年5月的一份备忘录中，查尔斯·德利西概述了一项基因组计划，将研讨会的结论与能源部各实验室的能力以及该部门管理大型研究项目的经验结合了起来。(genome.gov)

美国国家研究委员会1988年发布的报告《人类基因组的作图与测序》（Mapping and Sequencing the Human Genome）为联邦层面的行动提供了框架。委员会没有建议立即使用现有方法对整个基因组进行测序，而是主张改进图谱、开展测序技术研发的竞争，并为随后的规模化测序做好准备。该报告提议在15年内每年投入约2亿美元，研究经费主要通过个人研究者和小规模中心予以支持，同时共享数据和生物资源。在项目正式启动前的1988财年，美国国会就已为NIH和DOE拨出了专门的基因组研究专款。(nap.nationalacademies.org)

这一美国联合计划是通过一系列行政决策正式确立的。1988年10月，NIH与DOE签署了一份备忘录，协调双方的人类基因组研究和技术活动，与此同时NIH设立了人类基因组研究办公室。1989年10月1日，国家人类基因组研究中心成立以统筹NIH承担的工作，詹姆斯·D·沃森出任首任主任。1990年4月，两家机构联合发布了最初的五年规划，涵盖这项预期为期15年的事业中的1991至1995财年。1990年10月1日，人类基因组计划正式启动，最初目标定于2005年完成；其第一阶段重点关注使全面测序具备可行性所需的策略、技术、图谱和资源。(genome.gov)

国际组织架构、领导体制与资金投入

国际人类基因组测序联盟汇聚了来自美国、英国、日本、France|法国、德国和中国共20家测序中心的数百位科学家。该联盟并非依托单一实验室运作，而是一个协调一致的机构网络。贡献测序量最大的五个中心分别是：怀特海德研究所/麻省理工学院基因组研究中心、圣路易斯华盛顿大学医学院、休斯敦贝勒医学院、美国能源部联合基因组研究所，以及位于英格兰剑桥附近的威康信托桑格研究所。它们与规模较小的其他测序中心一道，共同提供了用于构建人类参考基因组的测序序列。(genome.gov)

其他参与机构还包括日本理化学研究所基因组科学综合研究中心与庆应义塾大学；法国国家基因测序中心（Genoscope）及位于埃夫里的法国国家科学研究中心联合单位；德国耶拿分子生物技术研究所、柏林马克斯·普朗克分子遗传学研究所与布伦瑞克德国生物技术研究中心；以及中国科学院北京基因组研究所/人类基因组中心。这些机构各自承担了分配给它们的序列片段，而非分别制作各自国家的基因组版本。测序通量主要集中在美国和英国，但该联盟有效整合了全部六个国家各个中心的技术力量。(genome.gov)

工作任务的分派取决于确定由哪家实验室负责已完成图谱定位的特定DNA片段。在1999年5月于冷泉港实验室举行的一次协调会议上，各参与中心一致同意继续对细菌人工染色体（具有已知物理图谱位置的大片段插入DNA克隆）进行测序。由美国国家生物技术信息中心维护的中央登记系统对各个中心正在测序的克隆进行追踪，以减少不必要的重复劳动。各中心都有指定的重点研究区域，会议报告显示没有任何基因组区域未被分派。各方计划通过季度会议监督研究进展，并在必要时重新调配任务。因此，这种分工并非各个国家对整条染色体的永久性瓜分，而是一种可动态调整的合作模式。(genome.gov)

项目的行政领导层与实验室一线测序工作相互独立。1989年10月，詹姆斯·D·沃森出任美国国立卫生研究院国家人类基因组研究中心首任主任，并于1992年4月辞职；迈克尔·戈特斯曼曾短暂代理主任职务，随后弗朗西斯·S·柯林斯于1993年4月获任命为正式主任。该中心于1997年升级为美国国家人类基因组研究所。美国国立卫生研究院与美国能源部共同统筹美国的项目规划，资助机构则向各参与单位的测序工作提供资金。在英国，威康信托基金会是该项目的主要资助方。约翰·苏尔斯顿在1992年至2000年间担任桑格中心主任，他主要负责建立并指导这一顶尖测序机构的运转，而非参与美国项目的行政管理；在他的领导下，该中心为2000年发布的工作草图贡献了约三分之一的测序数据。(genome.gov)

项目完工时报告的约27亿美元总支出，指的是以1991财年美元计价的美国国家项目经费，与之对应的最初预估开支基于同一口径约为30亿美元。这并非全球各国的总开支，其他参与国家提供的资金属额外支出。这笔款项也并非单纯用于人类DNA测序本身：美国投入的总预算还涵盖了遗传图谱与物理图谱绘制、技术研发、模式生物图谱构建与测序、生物伦理学研究以及项目行政管理。美国国家人类基因组研究所后来的财务分析估计，根据所包含的筹备与生产环节不同，生成首个人类参考基因组序列本身的实际成本约为5亿至10亿美元；该估算与整个项目27亿美元的总体预算属于不同的财务统计口径。(genome.gov)

图谱绘制、测序与组装

连锁图谱通过追踪家族中可变DNA标记的遗传规律来对这些标记排序：因减数分裂重组而分离频率越低的标记，推测在染色体上的距离越近。连锁图谱上的距离反映的是重组频率，而非固定的碱基数量。相比之下，物理图谱则是在DNA分子上确立路标与重叠区。序列标签位点（STS）是一段短小且具有特异可识别性的DNA序列，长度通常为200–500个碱基对，可通过聚合酶链式反应检出。STS提供了高度可重复的路标，研究人员借此将遗传图谱、物理图谱与克隆DNA片段关联起来。该计划于1994年绘制完成的连锁图谱使标记平均间距达到约1厘摩，提前一年实现了预定建图目标。(genome.gov)

大插入片段克隆为测序提供了实体材料。其中绝大多数是细菌人工染色体（BAC），携带的人类DNA插入片段长度通常为100–200千碱基。研究人员通过比对限制性核酸内切酶“指纹图谱”来鉴定相互重叠的克隆：即每种克隆的DNA被酶切后产生的片段大小分布谱样。相同的图谱特征支持克隆间存在重叠，从而可将克隆依序排列为连续的集合，即重叠群（contig）；已定位的路标则将这些重叠群锚定在染色体上。1998年10月，图谱绘制联盟开始对RPCI-11文库中的30万个BAC克隆进行指纹图谱分析。按平均插入片段150千碱基计算，这相当于对全基因组进行了约15倍的抽样覆盖。测序靶点的挑选旨在尽可能少地引入冗余重叠并跨越目标区域，而指纹比对则有助于剔除发生重排或其他不可靠的克隆。(genome.gov)

公共联盟采用了分层鸟枪法测序，亦称逐个克隆测序法。研究人员从选定且已定位的每个克隆中提取DNA，将其打断为更小的片段，亚克隆后再经桑格法测序读取。计算机将相互重叠的读取片段拼接为局部的序列重叠群；来自相邻重叠BAC的序列随后被合并为更大的染色体组装序列。这样一来，物理图谱便预先限定了各段序列应属的位置，无需将所有读取片段直接在整个基因组尺度上拼装比对。这种局部化策略减少了远端基因组位置上相似重复序列引发的混淆。图谱还指导了补洞克隆的筛选，以填补正在构建的组装序列中的缺口区域。(genome.gov)

自动化提高了实验室的通量与测序结果的均一性。四色荧光检测、染料标记的链终止剂、经改良的聚合酶、毛细管凝胶电泳以及自动化样本制备系统，共同支撑了测序读取片段的大规模产出。软件系统将这些实验测得的数据与序列组装衔接起来：PHRED软件负责碱基判读并估算错误概率，而PHRAP软件在组装重叠读取片段及评估最终一致序列时充分利用了质量评分信息。这些分值有助于将真实可信的重叠与由低质量数据造成的虚假匹配区分开来，并标出需要进一步补测核验的位点。(genome.gov)

完成图的整理（finishing）需要开展靶向实验，而非仅仅继续累积随机读取片段。研究人员需要排查不确定的碱基，确定序列区段的排列顺序与方向，获取跨越缺口的额外序列，并核实疑似的组装错误。克隆插入片段内部的缺口可能需要进行定向测序；而克隆之间的缺口则需开展额外的物理图谱构建与文库筛选工作。独立的质量评估还检验了提交入库的“完成版”序列是否达到该计划的标准。2004年的一项评估发现，碱基水平的准确率超过了原定每10,000个碱基不超过1个错误的标准约十倍。(nature.com)

**覆盖度与准确度衡量的是不同的特性。**测序深度描述的是对某一区域的重复抽样次数；基因组覆盖度描述的是目标基因组被测出部分所占的比例；碱基准确度描述的则是所获序列本身的错误率。因此，一个高度准确的组装区域并不能证明缺失区域已被找回，大量的抽样也无法确保重复DNA能够被正确组装。该联盟在2004年10月的报告中估算，在覆盖约99%常染色质基因组的同时，错误率约为每100,000个碱基出现1个错误。遗留的缺口往往与节段重复序列相关，在这些区域中，高度同源的重复拷贝给克隆定位与序列组装都带来了极大挑战。(genome.gov)

工作草图、塞莱拉与计划完成

1999年12月2日，伊恩·达纳姆（Ian Dunham）及其同事在《自然》（Nature）杂志上发表了人类22号染色体常染色质区域的测序结果，使其成为首条达到这一测序里程碑的人类染色体。报告的序列全长3340万个碱基对，分布在12个连续片段中。因此，这并非整条染色体完全不间断的连续序列：各片段之间仍存在间隙（gap），且该染色体富含重复序列的异染色质区域并未包含在报告的序列之内。尽管如此，该工作证明了以接近完成图的质量重构并分析人类大型染色体区域是可行的。(nature.com)

2000年6月26日，国际人类基因组测序协作组宣布绘制出人类基因组工作草图。在比尔·克林顿总统主持的白宫仪式上，弗朗西斯·柯林斯（Francis Collins）代表公共计划出席，与塞莱拉基因组公司（Celera Genomics）的J·克雷格·文特尔（J. Craig Venter）并肩亮相，后者也宣布了其公司首个基因组组装序列。这次联合出席旨在表彰双方各自取得的平行成就，而非双方联合拼接出了一份统一的序列。“工作草图”这一提法将广泛可用的序列与达到完成图质量的序列区分开来：当时仍存在间隙、序列顺序不确定以及尚未完全解析的区域，需要进一步开展工作。此次联合宣布也早于详细描述组装结果及其初步解读的正式科研论文发表。(genome.gov)

塞莱拉公司成立于1998年5月，目标是在三年内测出人类基因组的大部分序列。其全基因组鸟枪法策略将整个基因组的DNA随机打断，对随机片段进行测序，再借助计算手段重构它们之间的相互关系，而非先围绕大片段克隆的详细物理图谱来组织测序工作。塞莱拉于2001年2月发表的论文报告了约2730万条高质量读长（reads），相当于148亿个测序碱基，测序深度达到人类基因组的5.11倍。其发表的组装结果并非完全独立于公共计划的资源：其全基因组组装策略和区域染色体组装策略均将塞莱拉自身的读长数据与公共资助的测序数据结合在了一起。为了整合进组装之中，公共序列在计算处理时被切分成了550个碱基对大小的片段。(genome.gov)

两个阵营于2001年2月各自发表了论文。协作组以埃里克·兰德（Eric Lander）为第一作者的论文《人类基因组的初步测序与分析》（Initial sequencing and analysis of the human genome）发表在2月15日的《自然》杂志上；文特尔及其同事的论文《人类基因组序列》（The sequence of the human genome）则发表在2月16日的《科学》（Science）杂志上。这些报告介绍的是序列工作草图和初步分析，而非宣称已解析了所有染色体区域。公共协作组随后继续推进精细化完成阶段（finishing phase），用更长、排序更准确的连续序列取代零散的草图序列，并着力填补间隙、纠正组装错误。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

2003年4月14日，协作组正式宣布人类基因组计划完成，比原定2005年的期限提前了两年多。这一项目管理层面的里程碑与随后发表的技术论文有所不同——后者题为《人类基因组常染色质序列的完成》（Finishing the euchromatic sequence of the human genome），发表于2004年10月21日的《自然》杂志。该论文记录了约28.5亿个碱基，覆盖了约99%的常染色质DNA，尚存341个间隙。因此，“完成”指的是该项目完成了常染色质参考序列，而非每条染色体都达到了毫无间隙的程度。长且高度相似的重复序列——尤其是与着丝粒等结构相关的异染色质区域——利用当时可用的测序和组装方法仍难以可靠重构；部分常染色质区域的间隙也依然未能完全解决。(genome.gov)

公共数据库与数据共享原则

该计划的测序数据通过三个合作的公共数据库进行分发：美国国家生物技术信息中心维护的GenBank；欧洲生物信息学研究所的 EMBL 核苷酸序列数据库（随后并入欧洲核苷酸档案，ENA）；以及日本三岛国立遗传学研究所的日本 DNA 数据库（DDBJ）。这些归档机构接收序列提交，并每日交换已发布的记录，使得向其中一个合作方提交的数据可以通过其他合作方获取。通用的记录格式和注释规范为这一交换提供了支持。它们是收录多种生物序列的存储库，并非专门为人类基因组创建的数据库。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

快速分发不仅包括经检验可发表的成果，也涵盖了未完成的序列。联合开发的高通量基因组序列分区在基于克隆的测序工作尚在进行时就提供了访问途径。其记录将第一阶段（phase 1）序列（各组成片段可能尚未排序且方向未定）与第二阶段（phase 2）序列（片段已排序且方向确定，但尚未完全完成）区分开来。第三阶段（phase 3）则代表已完成的序列，这类序列会在保留其登录号的同时转入相应的一级数据库分区。未完成的记录带有明确警告，提示其可能包含错误。这一安排使研究人员能够在不把草图记录等同于完成序列的前提下，检索最新的序列数据。(ncbi.nlm.nih.gov)

支撑这一实践的政策确立于 1996 年 2 月在百慕大举行的首届人类基因组测序国际战略会议，并在 1997 年 2 月 27 日至 3 月 2 日举行的第二届会议上得到重申。“百慕大原则”呼吁将大约 1 至 2 千碱基对或更大的序列组装结果自动、迅速地发布到公有领域中，而不是扣留到期刊发表时才公开。1997 年 4 月，美国国家人类基因组研究所（NHGRI）开始实施一项要求，规定其资助的大规模测序项目必须在生成至少 2 千碱基对的组装序列后 24 小时内将其发布。重申的原则明确规定了无使用限制的公开发布。这些是关于序列信息发布的承诺，与随后基于这些数据发表科学分析的成果有所区分。(genome.gov)

数据发布规则还将组装序列与底层的实验原始输出区分开来。如果政策仅与组装结果挂钩，可能会延误对全基因组鸟枪法测序数据的获取，因为组装可能在测序过程的后期才进行。因此，NHGRI 在 2000 年 12 月扩展了其政策，要求每周将原始测序色谱图数据提交到 NCBI 和欧洲生物信息学研究所建立的公共峰图数据库中。因此，研究人员不仅能依赖测序中心重构的结果，还能直接获取底层的测序证据以及组装成品。(genome.gov)

然而，序列归档与基因组注释有所不同：归档的一段 DNA 本身并不能说明哪些部分构成了基因，也不能说明其转录本的结构如何。Ensembl 结合计算预测与支持性证据构建了基因模型，并为公共联盟的草图基因组分析提供了大量注释。基因组浏览器（包括 Ensembl、NCBI 的 Map Viewer 以及 W. James Kent 等人于 2002 年介绍的 UCSC 浏览器）将这些解读与组装好的序列并列呈现。染色体坐标为比较基因模型、信使RNA比对、预测的外显子、重复序列及其他特征提供了统一的基准轴。用户可以检查某一染色体区域，比对各种证据轨道，并检索相关序列。底层组装与这些注释层之间的分离，使得不同的基因预测及其支持证据能够被共同检视。(academic.oup.com)

基因组结构的主要发现

国际人类基因组测序协作组在2004年发布的组装版本（代号Build 35）包含约28.5亿个核苷酸，中间存在341个缺口。其约99%的覆盖率具体指的是常染色质——即染色质中浓缩程度相对较低且富含基因的部分——而非整个基因组。在余下的缺口中，有308个属于常染色质序列，估计涉及2800万个碱基；另有33个属于异染色质，约占1.98亿个碱基，异染色质并未被列为全面测序的目标。因此，如此高的覆盖率数据并不意味着每个着丝粒周围及其他区域的富含重复序列的区域都已被解析。(nature.com)

随着序列连续性和注释水平的提高，人们对蛋白质编码基因数量的估计不断下降。协作组在2001年的分析中提出了约30,000至40,000个基因，而在2004年的分析中将总数修正为20,000至25,000个。这些是基于证据的估算值，而非通过实验确认的基因的直接计数。注释工作结合了计算预测、互补DNA（cDNA）序列、表达序列标签（EST）以及与其他物种基因的相似性分析。草图序列中的缺口可能会将单个基因分割成数个表观基因，而假基因（即蛋白质编码能力已被破坏的基因拷贝）也可能被误认为是功能性编码基因。2004年的重新评估指出，对碎片化程度的低估是早期高估基因数量的主要原因。相反，短基因、单外显子基因或快速进化的基因则可能漏检。这些估算均未计入产生非蛋白质编码RNA的基因。(nature.com)

蛋白质编码序列仅占人类DNA的很小一部分：2001年的分析估算其仅占约1.5%。然而，由于外显子被内含子隔开（内含子会在RNA加工过程中被切除），基因所跨越的基因组区间要大得多。同一次分析估计，平均编码序列长度约为1,400个碱基，但在基因组上的平均跨度却约为30,000个碱基。可变剪接使外显子的不同组合能够形成不同的转录本，因此基因的数量并不等同于可能产生的蛋白质产物数量。这一极低的编码比例仅说明了用于编码蛋白质的序列分配比例，并不代表具有生物活性的基因组所占的比例。(nature.com)

重复序列是基因组组织的另一大显著特征。在草图序列中，约45%可被识别为源自转座元件，包括长散在核元件（LINE）、短散在核元件（如Alu等SINE）、长末端重复元件（LTR）以及DNA转座子。这些序列大多是远古插入留下的残迹，而非当前仍具有移动能力的元件。另一类独立的重复是片段重复，指复制到其他基因组位置的大片段序列；草图分析估计其约占基因组的5%。它们高度的序列相似性使得组装过程中难以区分不同的拷贝，这也是导致未解决缺口的重要原因。鉴定重复序列的演化来源或重复片段能够确立其序列关联，但其本身并不足以证明其在当下具有生物学功能。(ncbi.nlm.nih.gov)

基因在染色体之间以及染色体内部的分布均极不均匀。2004年对19号染色体的分析显示，其基因密度是全基因组平均水平的两倍以上。相比之下，对13号染色体的分析在已测序的9550万个碱基中仅识别出633个基因，约为每兆碱基6.5个基因；在该染色体中部一段3800万个碱基的区域内，基因密度更是下降至3.1个/兆碱基。这些染色体尺度的实例表明，基因组的组织结构不能用基因之间的均一平均间距来充分概括。(nature.com)

模式生物与其他研究资源

对实验中易于操作的模式生物进行基因组测序是人类基因组计划的明确目标，而不仅是人类基因组测序的副产品。共同的进化渊源使这些序列能够有效用于识别相关基因并研究保守的细胞过程。完整的基因目录也使系统性实验成为可能：例如敲除酵母的单个基因，即可揭示其对细胞存活或代谢的贡献。弗朗西斯·柯林斯（Francis Collins）及其同事发表的 1998–2003 年计划明确提出，要完成线虫和果蝇的测序，并启动小鼠的测序工作。小鼠与人类的基因组比对旨在鉴定保守的蛋白质编码区和非编码调控序列，而实验手段则可用于验证它们的功能。(genome.gov)

该计划涵盖了基因组复杂度逐步递增的多种生物。1996 年 4 月 24 日，一个国际科研联合体宣布完成了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）核基因组的测序：全长约 1210 万个碱基，分布在 16 条染色体上。安德烈·戈弗（André Goffeau）协调了欧洲的研究项目；在美方基因组计划的资助下，罗纳德·戴维斯（Ronald Davis）与马克·约翰斯顿（Mark Johnston）领导的美国团队贡献了约 21% 的序列。1997 年 9 月，弗雷德里克·布拉特纳（Frederick Blattner）及其同事发表了大肠杆菌（Escherichia coli）K-12 菌株的完整序列，为真核生物资源补充了细菌对照。1998 年 12 月，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）联合体报告了约 9700 万碱基的线虫基因组，这是多细胞动物的第一个基因组序列。(genome.gov)

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和小鼠的测序工作表明，成果发表与序列彻底完成（finishing）之间必须予以区分。2000 年 3 月发表的果蝇成果是公共测序团队与塞莱拉基因组公司（Celera Genomics）合作的结晶。该拼接组装覆盖了约 1.2 亿个碱基，包含了绝大多数基因，但并非覆盖果蝇基因组的每一处。截至 2003 年 4 月，该计划的成果记录将果蝇、线虫、酵母和大肠杆菌的资源归类为“完成版序列”（finished sequences）。相比之下，2002 年 12 月发表的小鼠资源则属于高级草图：它包含了小鼠常染色质区约 96% 的序列，其中约 95% 锚定在染色体上。尽管如此，它已能支持与人类 DNA 的广泛比对，比对范围涵盖了约 98% 的已知人类编码区。这些数据衡量的是序列的代表性覆盖程度，并不意味着每个基因组区域都已测透，也不代表每个基因的功能都已得到实验表征。(genome.gov)

相关的互补DNA（cDNA）文库提供了单纯依赖基因组序列无法获取的证据。这些信使 RNA 的 DNA 拷贝代表了实际表达的转录本；将其与基因组 DNA 进行比对，有助于确定编码序列和外显子边界。实体的 cDNA 克隆还为蛋白质表达和功能研究的实验提供了原材料。美国国立卫生研究院哺乳动物基因收藏计划（NIH Mammalian Gene Collection）于 2002 年报告了超过 15,000 条人与小鼠的全长 cDNA 序列。另外，该计划的成果统计表显示，截至 2003 年 3 月已收录 15,000 条人类全长 cDNA。这类文库利用实验获取的转录本序列，对基于计算预测的基因进行了有效补充。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

变异资源将该计划的视野拓展到了单一参考序列之外。尽管最初设定的目标是定位 10 万个人类单核苷酸多态性（SNP），但截至 2003 年 2 月，成果记录表已收录了 370 万个 SNP。SNP 标示了人类 DNA 序列在单核苷酸水平上存在差异的位点。绘制它们的分布位置为追踪遗传模式、探索特定基因组区域与疾病易感性之间的关联提供了标志物。因此，这一目录是用于变异研究的资源库，而非单纯记录已知致病突变的清单。(genome.gov)

供体样本与参考序列代表性

人类基因组计划的测序材料来自志愿者，其个人身份信息被刻意与样本进行了分离。原始序列的很大一部分来自纽约州布法罗招募的供体，罗斯威尔帕克癌症研究所（Roswell Park Cancer Institute）在那里制备了用于大规模测序的 DNA。招募工作通过公开发布广告进行；一份保留至今的 1997 年报纸广告展现了这一过程。志愿者提供了知情同意并采集了血液样本，研究人员从中提取出 DNA。项目指导方针建议将样本招募与实验室制备隔离开来：由人类遗传学部门负责获取知情同意与采集样本，随后将双盲样本提供给构建 DNA 文库的实验室。这种安排旨在防止文库制备人员获知供体身份，而不是为了确立基因组的匿名性能得到永久保证。(genome.gov)

提取出的 DNA 被转化为克隆片段的集合，即 DNA 文库。大片段被插入载体中（特别是细菌人工染色体），并在细菌中扩增繁殖，从而能够源源不断地提供特定的人类 DNA 片段。研究人员挑选重叠的克隆进行测序，并将其序列拼接组装成更长的染色体序列。因此，文库将单一的供体捐献与实验室中分别维护的诸多克隆联系起来；参考序列是由这些片段组装而成的，而非直接读取血液样本中完整的单条染色体。该国际联合体在 2001 年发表的论文中阐明了来自多个克隆来源序列的整合过程，明确指出了这一资源复合构建的特征。(genome.gov)

各供体的贡献极不平衡。根据美国国家人类基因组研究所的历史记载，最初的参考序列中约 70% 来自一位匿名供体，其余 30% 来自其他 19 位供体。这些百分比反映的是对已组装序列的贡献比例，而不是招募的志愿者人数或采集的血液量比例。由此产生的参考基因组实质上是一个嵌合体：相连的连续片段可能来自不同的供体，尽管其中一位供体提供了大部分序列。它既非那位主要供体的完整个人基因组，也不是 20 个人类基因组的等比例组合。(genome.gov)

参考序列也既不同于群体平均水平，也不同于个人的二倍体基因组。在已组装序列的特定位点上，它给出的是某一种具体的核苷酸，而非该位点各种替代等位基因在群体中的频率分布。其中的碱基并未通过筛选全球最常见的等位基因来进行系统选定。此外，一个人通常携带有每条常染色体的两个拷贝，分别遗传自父母双方；而最初的参考序列在每个组装好的染色体区域基本上只代表了一条单一的序列路径。因此，它没有保留任何一个供体的双亲染色体组或其变异组合。“参考”代表的是一个比对框架，而非生物学意义上的“正常”标准：与参考序列存在差异本身并不能证明其具有功能效应或与疾病存在关联。(genome.gov)

代表性有限会对基因组比对分析产生具体影响。在基于参考序列的分析中，测序读段在检测变异前需先比对到参考序列上。携带替代等位基因的读段相比与参考序列完全匹配的读段，比对难度可能更大；对于高度分化的区段或参考序列中缺失的插入序列，定位尤其困难。这种参考序列偏好（reference bias）可能导致变异被遗漏或反映不准确，其影响在不同基因组之间也存在差异。此外，极少数的供体样本也无法反映群体等位基因频率或涵盖全球的遗传多样性。这些局限性关乎参考序列本身的生物学代表性，与其所含 DNA 片段的测序准确程度无关。(genomebiology.biomedcentral.com)

伦理、法律与社会研究

1990年，美国基因组计划设立了“伦理、法律与社会影响”（ELSI）项目，分别由美国国立卫生研究院（NIH）和美国能源部（DOE）负责执行。该项目的宗旨是在产出科学知识的同时深入探讨遗传学研究带来的各种后果，而非等到相关技术进入临床应用后再行应对。在詹姆斯·沃森早期的领导下，伦理与社会研究获得了专项经费保障：NIH 和 DOE 将其各自基因组计划预算的大约 3% 至 5% 专门用于这项工作。该项目由此将对伦理学、法律以及社会后果的研究纳入了一项大型生物学研究工程的组织架构之中。(genome.gov)

知情同意与基因隐私是核心研究课题，因为基因研究结果不仅可能影响受试者本人，还会波及他们的亲属。研究人员深入探讨了知情同意流程是否充分说明了潜在的不确定风险与获益、保存的组织样本如何用于后续研究，以及如何防止研究结果过早披露。ELSI 与 NIH 研究风险保护办公室的合作促成了 1993 年机构审查委员会指南中关于人类遗传学研究的指导原则。临床研究还探讨了结果的解读与沟通方式：1991 年启动了针对囊性纤维化检测与遗传咨询的专项资助计划，随后在 1994 年启动了针对遗传性乳腺癌、卵巢癌和结肠癌症风险检测的资助计划。(genome.gov)

关于歧视的研究将遗传信息的产生与决定谁有权获取或使用该信息的决策区分开来。相关研究探讨了保险准入、就业、污名化，以及患有遗传性疾病人群及其家庭的切身经历。1993年，NIH 与 DOE 的联合工作组就遗传信息与健康保险问题发布了政策建议；ELSI 还参与了与美国平等就业机会委员会就基于遗传易感性产生就业歧视的探讨。这些活动将实证研究与政策制定相结合，但其建议本身并不构成法律，也无法全面杜绝歧视性使用。(genome.gov)

随着针对人类遗传变异开展大规模研究成为可能，1998—2003 年的项目规划进一步拓展了议程。该规划确定了五个相互关联的领域：完成测序与变异研究；将基因技术融入卫生保健和公共卫生；在非临床场景中的应用；与哲学、神学及伦理视角的交流互动；以及社会经济状况与种族和族裔观念的影响。因此，对结果的阐释不仅包括向个人解释检测结果，还包括考察社会类别如何塑造了研究课题的方向、服务获取的机会以及对不同群体间遗传差异的理解。生物学家、社会学家、卫生专业人员、历史学家和法学学者均参与了此项工作。(genome.gov)

通过对产学研关系的研究以及围绕基因组衍生资源获取途径的政策讨论，知识产权与商业化被提上议事日程。美国国家人类基因组研究所（NHGRI）在 1998 年 1 月面向大规模测序中心的招标公告中明确提出了制度立场：没有附加生物学信息的基因组序列数据应当免费开放，进入公共领域，并且不得申请专利。这是资助机构明确宣示的政策立场，既非对全部专利法的阐述，亦非对所有商业化应用的否定。NHGRI 在 2003 年的研究展望中，进一步将专利申请、许可与商业化列为利用基因组信息开发治疗手段及其他产品时必然伴随出现的关键议题。(genome.gov)

科学与生物医学影响

人类参考序列为研究基因和遗传变异提供了通用的坐标系统。研究人员可以将新测序的片段定位到染色体上的特定位置，识别附近的编码区或调控区，并比对不同实验室报告的变异。因此，基因发现不再高度依赖为每个疾病相关区域单独构建物理图谱：通过遗传连锁锁定的区间可以直接与现有序列及其注释进行比对搜索。该参考序列还为全基因组关联分析（GWAS）提供了支持，此类研究系统性地检验遗传标记与性状之间的关联。然而，这类关联只能定位候选区域，并不一定能直接确定致病变异或生物学机制。(nature.com)

跨物种比较将这些分析能力扩展到了基因组进化领域。通过比对人类与其他动物的序列，有助于区分保守区域与快速演化区域，并识别基因重复、基因缺失以及染色体重排。序列的保守性为生物学限制的存在提供了证据（包括蛋白质编码区之外的序列），但单凭保守性本身并不能确定某一区域的具体功能。2005年，黑猩猩测序与分析联盟报告了人类与黑猩猩基因组之间存在约3500万个单核苷酸差异和500万次插入/缺失事件。这一全基因组层面的目录使突变率和自然选择分析成为可能，而此前仅针对选定基因的比对是无法支持这些研究的。(nature.com)

在遗传性疾病研究中，参考序列成为了比对患者测序数据并评估候选突变的基础框架。萨拉·B·吴（Sarah B. Ng）及其同事领导的一项研究（于2009年11月在线发表，并刊登在2010年1月的《自然·遗传学》上）对来自三个患有米勒综合征家族的四名患者的蛋白质编码区进行了测序。通过比对公共数据库和对照外显子组过滤变异，他们锁定 DHODH 为隐性遗传模式下唯一的共有候选基因；随后的靶向测序证实了其他家族中的突变。这一成果开创了一条无需先在大型家系中进行定位即可发现罕见病致病基因的途径。该方法依赖于参考序列、随后的测序技术以及分析过滤流程——而非单靠参考序列本身——且它阐明的是致病机制而非治疗方法。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

在癌症研究中，通过将肿瘤DNA与匹配的非肿瘤DNA进行比对，使得在全基因组范围内区分获得性突变与遗传性变异成为可能。2008年，蒂莫西·J·莱（Timothy J. Ley）及其同事将该方法应用于急性髓系白血病，在一名患者的肿瘤中发现了十个改变蛋白质的体细胞突变。其中有几个受影响的基因在常规的靶向测序中绝非显而易见的候选基因。这表明全基因组分析能够揭示此前未曾预料到的疾病通路；但发现突变并不等同于证实每个突变都能驱动肿瘤生长，或构成有效的治疗靶点。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

参考序列还为药物基因组学提供了有力支持，该学科致力于研究遗传差异如何影响药物反应和毒性。要具备临床实用价值，仅发现某种关联是不够的，还需要更充分的证据。在2008年的 PREDICT-1 随机试验中，西蒙·马拉尔（Simon Mallal）及其同事对来自19个国家的1956名患者进行了研究。筛查 HLA-B*5701 等位基因并排除携带者使用阿巴卡韦，使免疫学证实的过敏反应发生率从对照组的 2.7% 降至筛查组的零。这证明了特定基因检测的实际应用价值，但并不意味着全基因组层面的药物反应预测已普遍成熟。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

该计划还强化了由大型测序中心、自动化生产和计算分析构成的基础设施。美国国家人类基因组研究所（NHGRI）报告指出，测定最初的10亿个碱基对耗时约四年，而第二个10亿个碱基对仅用了四个月。处理这些海量产出使生物信息学——涵盖序列组装、存储、注释和比对——成为生物学研究中不可或缺的组成部分。最初的五年规划明确提出了跨学科人才培养的目标，将生物学与计算、工程、数学及相关学科紧密结合。2003年之后，各测序项目将这套基础设施转向遗传疾病和其他生物学问题的研究。大规模并行测序及随后的临床应用，是部分依托这些资源发展起来的后续成果，而非该计划本身直接交付的技术或医疗产物。(genome.gov)

参考序列的改进与后续计划

人类基因组计划结束后，对参考基因组的维护工作仍在继续。基因组参考联盟（GRC）不断纠正组装错误、填补序列空缺，并为高度变异的区域增补替代序列表示。其主要发布的版本包括2009年的GRCh37，以及2013年12月24日发布的GRCh38。这些版本修正了用于确定基因和变异物理位置的参考基因组本身，而不仅仅是对原有未变序列进行重新注释。在两次主要版本发布之间，GRC通过发布补丁来提供修正或增补的序列，同时不改变主染色体的坐标系统。这种做法既为既有分析保留了稳定的坐标框架，又提供了改进后的局部组装序列。此外，引入替代位点序列也表明人们认识到：某些基因组区域无法用单一的线性序列来充分表征。(ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov)

另一些科研计划则利用该参考序列来编目人群间的遗传差异，而非修补参考序列本身。2002年10月启动的“国际单倍型图计划”（HapMap）绘制了常见变异及其在染色体上的关联图谱。该项目定义的单倍型——即通常共同遗传的邻近等位基因组合——使得研究人员可以通过选定的标记位点推断出与其相关的变异信息，从而为全基因组关联分析提供了有力支持。“千人基因组计划”则通过测序技术进一步扩大了变异发现的广度：其2015年的分析报告涵盖了来自26个群体的2504名个体，共发现逾8800万个变异，其中包括8470万个单核苷酸多态性、360万个短插入与缺失，以及约6万个结构变异。这些资源提供了变异频率和单倍型信息，但其目的并非替换既有的染色体组装序列，也未通过实验确定每种变异的具体生物学功能。(genome.gov)

2003年启动的DNA元件百科全书（ENCODE）计划则致力于基因组的功能注释。该计划通过一系列实验，系统测定了不同细胞类型和组织中的RNA转录产物、转录因子结合位点、DNA可及性以及染色质特征。整合这些测定数据有助于鉴定候选调控区（包括启动子和增强子），并将序列坐标与生化活性联系起来。例如，该联盟在2020年的报告中，基于DNA可及性和染色质修饰数据，构建了一个可扩充的候选顺式调控元件登记库。此类注释揭示的是序列在特定生物学环境下的活性证据；它们与人群变异目录性质不同，其本身并不能直接证明某一元件对整个机体的具体影响。(genome.gov)

另一大局限——重复序列缺失——则由“端粒到端粒”联盟（T2T）得以解决。2022年3月，谢尔盖·诺克（Sergey Nurk）及其同事发表了T2T-CHM13组装序列，全长30.55亿碱基对，填补了以往参考基因组中缺失的近2亿个碱基。该工作将高精度的太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences）HiFi长读段与牛津纳米孔（Oxford Nanopore）超长读段相结合，成功区分了相似的重复序列拷贝，并在较长跨度上将其连通，从而解析了着丝粒和大片段重复等以往无法测序的区域。该组装采用了高度纯合的CHM13细胞系，降低了分离不同亲本序列的难度。该版本涵盖了22条常染色体和X染色体，不含Y染色体。因此，“完整”一词仅指该组装序列的覆盖度达到了端到端无缺口，并不意味着它囊括了所有类型的人类染色体结构或人类的所有遗传多样性。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

2023年5月，廖文伟（Wen-Wei Liao）及其同事代表人类泛基因组参考联盟发表了首个人类泛基因组参考草图，该草图包含来自47名遗传多样性个体的定相二倍体组装序列。定相分析将每个个体遗传自父母的两套染色体分离开来，由此生成了94套单倍型组装，而不是将其差异合并为一条共有序列。基于图形的泛基因组表示法将共有序列连接起来，同时在变异区域保留替代路径，使得插入、缺失和更复杂的基因组重排能够并存展现。相较于GRCh38，该草图增补了1.19亿碱基对的多态性常染色质序列和1115个基因重复。它是人类基因组计划构建参考基因组工作在新阶段的延续，属于独立组织的多元基因组资源；入选的47名个体是这一新计划的贡献者，并非原人类基因组计划组装序列的新增供体。(nature.com)

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