聚合酶链式反应（PCR）是一种实验室技术，可将选定的脱氧核糖核酸（DNA）片段复制成数百万至数十亿份。该技术利用人工合成的短引物识别目标片段，再通过多轮酶介导的复制将其扩增。PCR是分子生物学的基础方法，使研究人员能够分析原本含量过低、无法满足许多实验操作要求的遗传物质。其应用涵盖研究、鉴定和临床检测。(genome.gov)
发展历程
PCR由凯利·穆利斯开发，于1985年首次公开介绍。1993年，穆利斯因发明这一方法而获得当年诺贝尔化学奖的一半奖金；另一半授予迈克尔·史密斯，以表彰其在定点诱变方面的独立研究。该奖项肯定了这些方法对DNA实验操作和分析能力的显著拓展。(nobelprize.org)
一项重要的实践进展是引入Taq聚合酶。这种耐热的DNA复制酶最初从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离得到。其热稳定性使它能够在反复加热的循环中持续发挥作用。称为热循环仪的自动化仪器负责控制这些温度变化，使扩增结果具有可重复性，并减少人工操作。后续改进包括使用准确性更高的聚合酶，以及针对难以扩增的模板优化试剂。(thermofisher.com)
分子原理与组成
PCR依赖碱基互补配对以及DNA聚合酶的活性。DNA聚合酶是一种以已有DNA链为模板合成新DNA链的酶。两条引物分别结合在两条模板链上，结合位点位于选定区域的两侧。引物的朝向使DNA合成能够朝目标区域进行并穿过该区域，从而确定扩增片段（又称扩增子）的边界。聚合酶从每条引物的3′端开始延伸。(thermofisher.com)
典型的反应体系含有模板DNA、两条引物、耐热聚合酶、四种脱氧核苷三磷酸，以及含镁离子的缓冲液。脱氧核苷三磷酸为新链提供合成原料。镁离子有助于聚合酶发挥活性，而缓冲液的组成和酸碱度会影响反应表现。引物序列、模板质量以及各试剂的配比都会影响扩增的特异性和产量。(thermofisher.com)
与活细胞内的扩增不同，PCR在实验室反应混合物中进行。新合成的DNA在后续循环中成为模板，由此形成链式重复过程，这也是该方法名称的由来。(genome.gov)
温度循环与产物检测
常规PCR反复进行三个主要阶段：
- **变性：**通过加热将双链DNA分离为单链，常用温度约为94–98°C。
- **退火：**降温使引物能够与互补序列结合。所需温度取决于引物组成和反应条件。
- **延伸：**聚合酶向已结合的引物上添加核苷酸。对于许多常用酶，这一过程在约68–72°C下进行。(videos.thermofisher.com)
一次PCR通常包含约25–35个循环，但具体循环数因检测方法而异。在理想条件下，指数扩增阶段每个循环的DNA量接近翻倍。实际扩增效率往往较低或有所波动；随着反应条件逐渐成为限制因素，扩增最终会减慢。因此，最终出现的平台期使常规PCR的终点产量无法直接用来衡量起始DNA量。(thermofisher.com)
终点产物通常通过凝胶电泳进行检测，该方法按大小分离DNA片段。在预期大小附近出现条带，可作为扩增成功的证据，但仅凭片段大小无法确认其序列身份。产物随后可用于DNA测序、克隆或其他分析。(videos.thermofisher.com)
主要变体
**逆转录PCR（RT-PCR）**以RNA为起始材料。逆转录酶将RNA转化为互补DNA，再对其进行扩增。这使包括信使RNA和病毒RNA在内的RNA靶标能够接受基于PCR的分析。“RT”表示逆转录，而不是实时测量；不过，这两个过程可以在RT-qPCR中结合使用。(bio-rad.com)
**实时定量PCR（qPCR）**在循环过程中通过荧光信号监测扩增。信号超过设定阈值时对应的循环数，可提供有关起始靶标量的信息。结果解读取决于扩增效率、校准或归一化处理，以及适当的对照。这与仅在扩增完成后测量累积产物的做法不同。(bio-rad.com)
**数字PCR**将样本分配到大量彼此独立的反应单元中。扩增后，各单元被判定为阳性或阴性。利用泊松分布统计方法，可以将含有多个靶分子的反应单元纳入计算，从而无需常规标准曲线即可估算靶标浓度。其应用包括稀有序列检测和拷贝数分析。(bio-rad.com)
应用
PCR为研究基因、鉴定突变，以及制备用于测序或重组DNA操作的片段提供材料。在遗传学中，它用于辅助分析遗传变异。PCR也在人类基因组计划的基因组图谱绘制工作中发挥了广泛作用。(videos.thermofisher.com)
法医学应用包括从微量样本中进行DNA指纹分析。临床检测采用基于PCR的方法诊断遗传性疾病，以及检测细菌或病毒。这类检测识别的是特定核酸序列，而非直接观察完整的生物体。对于流感，检出病毒RNA并不一定表明存在具有感染活性的病毒，或病毒仍在持续复制。(genome.gov)
局限性与质量控制
PCR可能扩增因污染而引入的非目标DNA。引物特异性不足可能产生无关片段，而模板受损、存在抑制性物质或反应条件不合适，都可能导致扩增失败。引物之间也可能相互作用，形成引物二聚体，而不是预期产物。(neb.com)
设置对照有助于区分这些问题与真实结果。无模板对照有助于发现污染；阳性对照用于检查扩增能否正常进行。在以RNA为起始材料的实验中，不添加逆转录酶的对照可揭示基因组DNA污染。内对照则有助于识别反应抑制或样本质量差异。(bio-rad.com)
不同聚合酶的复制准确性也有所不同。Taq聚合酶缺乏某些高保真酶所具有的校对活性。具有校对功能的聚合酶可通过3′至5′外切核酸酶活性，移除错误掺入的碱基，从而在要求准确复制的应用中减少序列错误。(neb.com)