抗体偶联药物

抗体偶联药物（ADC）是一种治疗性药物，其通过连接子将抗体（通常为单克隆抗体）与药物化学结合在一起。在肿瘤治疗中，抗体负责识别细胞表面的靶抗原，而连接的药物（称为有效载荷或弹头）则发挥细胞毒活性。与靶点结合后，许多ADC会进入细胞内，并通过细胞内降解或裂解加工释放出活性药物。这种设计将分子识别与定向药物递送相结合，而非仅仅将抗体与药物联合给药。(cancer.gov)

ADC在某些特定类型的血液肿瘤和实体瘤（包括某些亚型的乳腺癌）的治疗中发挥着重要作用。其性能取决于抗体、连接子、有效载荷以及偶联化学技术的相互协同，同时也与肿瘤自身的生物学特性密切相关。靶向递送并不能完全避免对健康组织的损伤：活性药物引起的全身暴露、治疗相关毒性以及耐药性仍是ADC应用中的关键限制。因此，要深入了解ADC，必须将其作为一套综合的治疗系统，统筹考虑其分子工程构建、细胞作用机制、生产工艺、临床循证医学证据以及安全性。(cancer.gov)

定义与治疗界限

抗体偶联药物（ADC）是一种由三个核心部分构成的治疗性结构：抗体或抗体片段、化学连接子（linker）以及药物有效载荷（payload）。在本文所讨论的肿瘤学 ADC 中，有效载荷是通过共价键与抗体化学连接的细胞毒性小分子。抗体负责识别靶抗原，连接子负责将各组分结合在一起，而有效载荷则发挥杀伤细胞的活性。这些角色彼此互补而非可互相替代：抗体本身并非所附着的化疗药物，连接子属于递送系统的一部分，而非单独给药的治疗手段。(fda.gov)

完整的偶联物必须与其未偶联的各组分区分开来。“偶联抗体”指携带有连接有效载荷的抗体，而未偶联抗体则不携带载荷；未偶联有效载荷是指不再连接在抗体上的游离药物。体内对偶联物的代谢处理还会产生含有药物的降解产物。因此，给药后的 ADC 以及随后存在于体内的物质并不是单一且化学性质恒定的实体。它们的生物活性与处置过程可能各不相同，因此仅检测抗体量并不一定能反映仍与抗体结合的药物量。这种差异正是临床药理学中对偶联物与相关组分分别进行评估的基础。(fda.gov)

化学连接使 ADC 既不同于未偶联的治疗性单克隆抗体，也不同于抗体与化学治疗分别给药的联合方案。恩美曲妥珠单抗（trastuzumab emtansine，又称 T-DM1）清楚地说明了这一区别：它由靶向 HER2 的抗体曲妥珠单抗、MCC 连接子以及美坦新衍生物类药物 DM1 组成。单独的曲妥珠单抗缺乏这种连接的有效载荷；而将曲妥珠单抗与一种独立的化疗药物同时给药并不能构成 ADC。尽管如此，其中的抗体成分依然可以保留药理活性：在 T-DM1 中，抗体既能识别 HER2，又能抑制 HER2 相关信号通路，而连接的 DM1 则提供了额外的细胞毒性机制。(cancer.gov)

ADC 属于更广泛的免疫偶联物范畴，后者指将免疫靶向组分与另一种功能性物质连接而成的结构。该大类还包括用于放射免疫治疗的抗体-放射性核素复合物（由辐射发挥破坏作用），以及携带毒性蛋白质而非小分子药物的基于抗体的免疫毒素。后一种架构的典型例子是抗 EpCAM-假单胞菌外毒素融合蛋白，它将抗体片段与一种毒性蛋白质结合在一起。这些结构都具有抗体介导的靶向性，但递送物质的本质不同；因此，在本文中并不将它们视作小分子 ADC 疗法的等同形式。(cancer.gov)

本文的讨论重点是携带细胞毒性小分子有效载荷的肿瘤学 ADC。这一范围与美国食品药品监督管理局（FDA）于 2024 年 3 月发布的指南《抗体偶联药物的临床药理学考量》（Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates）的适用范围相吻合。该指南明确提示，其原则可能不适用于携带其他类型有效载荷的偶联物，也不适用于肿瘤学以外的适应症。因此，仅凭抗体靶向机制，并不能推定某种结构与用于癌症的细胞毒性 ADC 具有相同的作用机制、研发要求或治疗界限；这些属性同样取决于所连接的物质和预期的临床用途。(fda.gov)

发展历程与监管里程碑

吉妥珠单抗奥佐米星（Mylotarg，最初代号为 CMA-676）率先将抗体导向递送强效细胞毒药物的技术引入临床实践。它将人源化抗 CD33 单克隆抗体与一种卡奇霉素衍生物结合：对 CD33 的识别促进了细胞摄取并递送可导致脱氧核糖核酸双链断裂的药物。因此，该药物的研发验证了抗原识别能否在急性髓系白血病（AML）中转化为具有临床应用价值的药物递送，而不仅仅停留在识别恶性细胞的层面。2000年5月17日，美国食品药品监督管理局（FDA）授予其加速批准，用于治疗年龄在60岁或以上、被认为不适宜接受其他细胞毒化疗的 CD33 阳性 AML 首次复发患者。获批的给药方案为 $9\,\mathrm{mg/m^2}$，间隔14天给药两次；该批准依据的是缓解反应，而非经随机试验证实的生存期改善。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

随后开展的确证性研究 S0106 则评估了另一种给药情境：60岁及以下既往未经治疗的成年患者在诱导期接受柔红霉素和阿糖胞苷治疗，同时联合或不联合 $6\,\mathrm{mg/m^2}$ 的吉妥珠单抗奥佐米星。这项随机对照试验未能证实预期的临床获益，并显示含有偶联物的治疗组致死性诱导期毒性发生率更高——达到5.8%，而对照组仅为1.3%。吉妥珠单抗奥佐米星随后于2010年自愿退出美国市场。因此，这次退市源于确证性研究中不利的疗效和安全性评估，而非单纯因为出现生产制造问题或放弃靶向 CD33。(accessdata.fda.gov)

该药于2017年9月1日重新获批上市，主要依托于新的临床证据和调整后的给药剂量，而非恢复原先的方案。在法国针对新诊断 AML 的随机研究 ALFA-0701 中，诱导治疗方案在柔红霉素和阿糖胞苷的基础上，纳入了分次给药的吉妥珠单抗奥佐米星（在第1、4、7天分别给予 $3\,\mathrm{mg/m^2}$）。FDA 批准的药品说明书记载，吉妥珠单抗奥佐米星联合治疗组的中位无事件生存期为17.3个月，而单纯化疗组为9.5个月，风险比为0.56。针对复发性疾病，MyloFrance-1 研究为相同的分次诱导方案提供了证据：57名患者中有15名达到完全缓解。2017年的批准覆盖了成人新诊断的 CD33 阳性 AML，以及两岁及以上患者的复发或难治性 CD33 阳性 AML。这些支持性研究将较低的单次剂量与分次给药方案，同最初的单药方案以及 S0106 研究明确区分开来。(purplebooksearch.fda.gov)

此后的研发进一步将 ADC 的应用从血液系统恶性肿瘤拓展至实体瘤，并放宽了被认为足以作为靶标的表达水平界限。德曲妥珠单抗（Trastuzumab deruxtecan）于2019年12月20日获得美国加速批准，用于在转移阶段接受过至少两种抗 HER2 方案治疗的不可切除或转移性 HER2 阳性乳腺癌。2022年8月5日，DESTINY-Breast04 的研究结果支持其获批用于既往接受过治疗的不可切除或转移性 HER2 低表达乳腺癌——这一群体在以往的治疗分类中通常被划为 HER2 阴性。2025年1月27日，FDA 进一步批准其用于治疗在转移阶段接受过一种或多种内分泌治疗后进展的激素受体阳性、HER2 低表达或 HER2 超低表达晚期乳腺癌。后一项适应症将 HER2 超低表达定义为免疫组织化学评分（IHC）为0且伴有细胞膜染色。这些进展均属于针对特定药物和试验的生物标志物适用范围拓展，并不意味着所有靶向 HER2 的偶联物在靶标低表达水平下均可相互替代。(aacrjournals.org)

抗原选择与抗体设计

抗体通过识别细胞表面抗原上暴露的表位发挥作用，这使得抗原表达成为选择性结合的分子基础，而不仅仅依赖癌症本身的临床诊断。HER2、Trop-2 和 nectin-4 展现了不同的表面蛋白如何作为药物递送的“归巢地址”。美国国家癌症研究所开展的 II 期 ADC MATCH 试验分别针对这三个靶点，对德曲妥珠单抗（trastuzumab deruxtecan）、戈沙妥珠单抗（sacituzumab govitecan）和维恩妥尤单抗（enfortumab vedotin）展开研究。其筛选方案要求在分配治疗队列之前，先进行 RNA 表达检测，随后通过免疫组织化学确认蛋白质表达。这些属于该试验内部设定的探索性生物标志物标准，并非各药物通用的适应证入组规则。(fda.gov)

抗原丰度与抗原异质性描述的是不同的生物学特征。丰度指单个细胞上存在多少可用靶点；异质性则描述靶点在细胞群或不同样本间的分布情况。肿瘤间异质性是指不同的标本具有不同的总体表达水平。肿瘤内异质性则是指强表达、弱表达和抗原阴性的细胞共存于同一病灶内；单一的组织平均测量值无法反映这种空间混合状态。在 2016 年关于 DS-8201a（后定名为德曲妥珠单抗）的研究中，荻谷祐辅（Yusuke Ogitani）及其同事将 HER2 高表达和低表达的患者来源模型，与人为混合的 HER2 阳性和 HER2 阴性细胞群进行了区分。这些模型解答了不同的靶向问题：偶联药物在总体表达水平较低时是否仍能起效，以及它是否能对异质性肿瘤内部邻近的抗原阴性细胞产生影响。有效载荷对邻近细胞产生的依赖性效应（如旁观者效应）可以在不改变抗体本身抗原特异性的前提下，改变这种异质性所带来的结局。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

特异性、结合亲和力与组织穿透力同样是截然不同的概念。特异性决定了抗体识别何种分子结构；亲和力决定了单次结合反应的强度。提高亲和力并不必然会改善药物在整个实体瘤中的递送效果。在 2011 年一项利用识别相同表位的抗 HER2 抗体开展的实验研究中，斯蒂芬·鲁德尼克（Stephen Rudnick）及其同事发现，高亲和力抗体可能会在刚进入肿瘤位点处发生更大量的内吞和降解，反而限制了其向组织深部的穿透。这种“结合位点屏障”将抗体设计与抗原密度及周转速度联系在一起：局部的强烈滞留可能与病灶其他区域的药物暴露不足并存。因此，抗原选择与抗体优化绝不能简单等同于分别将靶点表达量或结合强度最大化。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

ADC 中的靶向组分可以是全长免疫球蛋白G、抗体片段，或是经过工程化改造的结合单元组合。MEDI4276 提供了一个具有文献记录的临床试验用双特异性构型范例，更确切地说，它属于“双互补位”（biparatopic）抗体：它识别的是同一抗原上的两个不同表位，而非两种不同的抗原。该分子的四价结构将曲妥珠单抗来源的单链可变区片段连接至抗 HER2 抗体 39S 的重链上，从而提供针对 HER2 胞外结构域 4 和结构域 2 的结合位点。这种排列方式能够交联相邻受体，促进受体成簇并加速内吞。在马克·佩格拉姆（Mark Pegram）等人于 2021 年发表的 I 期临床研究中，47 名晚期 HER2 阳性乳腺癌或胃癌患者接受了 MEDI4276 治疗。该研究证实了其抗肿瘤活性，但同时也观察到显著的耐受性限制；这项试验评估的是一种探索性构建体，而非已获批的确立疗法。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

抗体在 ADC 中可以主要充当递送载体，其自身的药理活性也可能与有效载荷的杀伤作用协同发挥疗效。美国食品药品监督管理局（FDA）的指导原则明确承认了抗体仅充当载体的情形。相反，泰穆·容蒂拉（Teemu Junttila）等人于 2010 年在线发表的实验表明，恩美曲妥珠单抗保留了未偶联曲妥珠单抗的多种活性，包括抑制 HER2 相关的 PI3K–AKT 信号通路、抑制 HER2 胞外域脱落，以及通过 Fc 受体介导招募能够产生抗体依赖性细胞介导细胞毒作用（ADCC）的免疫细胞。由此可见，靶点结合既可实现药物递送，又可介导抗体自身的生物学效应；两者的相对贡献比例必须针对特定偶联药物进行具体评估，而不能仅凭抗原识别机制直接推论。(fda.gov)

连接子与载荷化学

连接子化学不仅决定了偶联物在体液循环中的稳定性，也决定了其降解过程中所产生的含药产物的化学结构。可裂解连接子含有释放触发机制，例如蛋白酶敏感肽、酸敏感腙或可还原二硫键；而不可裂解连接子则主要依赖抗体的完全降解，以生成具有活性的“药物-连接子-氨基酸”分解代谢物。这两种是不同的释放策略，而非简单的效力优劣之分。2008年，Gail D. Lewis Phillips 及其同事在对比曲妥珠单抗-美坦新类构建体时发现，在其测试的临床前模型中，不可还原的硫醚键连接的曲妥珠单抗-DM1表现出优于二硫键连接构建体的活性。这一结果说明了为何必须将连接子的稳定性与载荷的活性结合起来进行综合评估。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

蛋白酶裂解型设计可以在肽触发基团与载荷之间引入一个自降解间隔基。在缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基系统中，溶酶体蛋白水解作用会引发间隔基的裂解碎片化，从而释放出游离药物，而无需抗体完全降解。然而，裂解前的稳定性也是一项独立的要求：过早释放会改变细胞毒性化合物的递送部位。Svetlana Doronina 及其同事于 2003 年报告称，与他们检测的腙键连接奥瑞他汀构建体相比，肽连接的单甲基奥瑞他汀 E 偶联物在缓冲液和血浆中明显更为稳定。随后对定点奥瑞他汀偶联物的实验表明，即使保持相同的释放化学机制，抗体上的偶联位点也会改变可裂解连接子的血浆稳定性。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

奥瑞他汀类和美坦新类属于化学结构各异的小分子载荷家族，并非对抗体蛋白质序列本身的修饰。奥瑞他汀类衍生物——包括单甲基奥瑞他汀 E（MMAE）和单甲基奥瑞他汀 D（MMAD）——能抑制依赖微管蛋白的微管组装。DM1 则是一种具有抗微管活性的含巯基美坦新类药物。在曲妥珠单抗恩美曲辛中，DM1 通过基于 SMCC 的不可裂解硫醚连接子偶联。因此，抗体降解并不会简单地释放出未经修饰的 DM1：其主要活性产物之一是赖氨酸-MCC-DM1（也称 Lys-SMCC-DM1），它同时保留了连接子成分和源自抗体的赖氨酸残基。因此，必须将其生物活性与游离 DM1 加以区分。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

基于德鲁替康的偶联物采用了另一类载荷：衍生自依喜替康的拓扑异构酶 I抑制剂。在后来被命名为德曲妥珠单抗的 DS-8201a 构建体中，抗 HER2 抗体通过基于甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸四肽的可裂解连接子与依喜替康衍生物 DXd 相连。这一设计摒弃了 DM1 针对微管的化学策略，转而采用了靶向参与 DNA 拓扑结构调控的酶的载荷。Yusuke Ogitani 及其同事在 2016 年的研究中报道了这一药物-连接子平台，并研究了针对 CD30、CD33、CD70 和 B7-H3 的相关 DXd 偶联物，证明该载荷-连接子技术在实验上可适用于多种抗体。不过，这些都属于临床前研究结果，并不意味着由此制备的偶联物在临床上可以相互替代。(aacrjournals.org)

释放出的化学实体形态还会决定载荷穿过细胞膜的难易程度。在 Ogitani 等人于 2016 年开展的对比实验中，DS-8201a 释放出的具有膜通透性的 DXd 在 pH 7.4 时的分配系数 $\log D$ 为 2.3，而 Lys-SMCC-DM1 仅为 0.2，且 DXd 在人造膜测试中表现出显著更高的通透性。这种通透性使得药物能够离开靶细胞并可能进入邻近细胞，从而为旁观者杀伤效应提供了化学基础。然而，被动渗透性较低并不意味着在细胞内失去活性：Ryuto Tomabechi 及其同事于 2022 年证实，溶酶体转运蛋白 SLC46A3 可以直接转运 Lys-SMCC-DM1。因此，连接子残留物和保留的氨基酸残基虽然会改变跨膜机制及转运需求，但并不会彻底剥夺载荷的活性。(onlinelibrary.wiley.com)

偶联与分子异质性

药物抗体比（DAR）指偶联到单个抗体分子上的载荷分子数量。单个抗体分子具有整数载荷，而制剂通常用平均 DAR 来描述。若 $f_n$ 为结合了 $n$ 个载荷分子的抗体分子的摩尔分数，则平均值为 $\overline{\mathrm{DAR}}=\sum_n n f_n$，其中 $\sum_n f_n=1$。该平均值并未规定载荷的分布状态：从数学角度而言，等比例混合的 DAR-2 和 DAR-6 分子与纯粹均一的 DAR-4 组分所得到的平均值同样是 4。在待表征的制剂中若包含未偶联的抗体，则其构成 DAR-0 组分；美国食品药品监督管理局（FDA）2024 年 3 月发布的临床药理学指南已将其与至少携带一个载荷的 ADC 分子作出了区分。(fda.gov)

传统的偶联策略利用天然氨基酸侧链，尤其是溶剂可及的赖氨酸氨基，或是通过还原链间二硫键暴露的半胱氨酸巯基。由于存在多个可反应的残基，所制备的材料在载荷数量和连接位置上均可能存在差异。这属于异质性的不同维度：即使 DAR 完全相同的分子，其药物连接位点也可能截然不同。定点偶联技术则转而引入特定的反应基团，例如经基因工程改造的半胱氨酸或具有独特化学活性的非天然氨基酸，从而将偶联限制在预设位置。因此，这类方法不仅能收窄药物载荷的分布范围，更能同时控制偶联反应的化学计量比与偶联位点。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

非天然氨基酸的掺入为实现这种控制提供了一条经过实验验证的途径。2012 年，Jun Y. Axup 及其同事将对乙酰苯丙氨酸引入抗 HER2 Fab 片段及全长 IgG 中，随后通过肟键偶联奥里斯他汀衍生物。引入的侧链酮能特异性地与药物连接子上的氨氧基发生反应，呈现出与常规抗体残基截然不同的化学活性。2014 年，Feng Tian 及其同事将该方法扩展至稳定的中国仓鼠卵巢细胞系中，工程抗体的表达滴度超过 $1\ \mathrm{g/L}$。他们以抗 HER2 和抗 5T4 抗体为基础，通过蛋白酶可裂解或不可裂解的连接子偶联经羟胺功能化的单甲基奥里斯他汀 D。在临床前实验中，部分不可裂解偶联物相较于通过半胱氨酸偶联的对照组，表现出更优异的稳定性和抗肿瘤活性。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

连接位点与连接子的化学结构无法割裂评估。在 2012 年的一项研究中，Ben-Quan Shen 及其同事在抗 HER2 抗体上引入了三个溶剂可及性和局部电荷各异的半胱氨酸位点。在高度暴露的位点上，顺丁烯二酰亚胺连接的偶联成分会因与血浆巯基（包括白蛋白、半胱氨酸及谷胱甘肽中的巯基）发生交换而脱落。相反，一个部分可及且带正电荷的位点则促进了连接子琥珀酰亚胺环的水解，从而抑制了这种交换。这些差异直接影响了偶联物在小鼠乳腺癌模型中的稳定性和治疗活性：仅指定偶联残基并不能决定抗体-连接子界面的稳定性。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

更高的药物载荷同样并不总能提升生物学性能。Kevin J. Hamblett 及其同事在 2004 年的一项研究中，分离纯化了每个抗体分别结合 2、4 或 8 个药物分子的抗 CD30-单甲基奥里斯他汀 E 偶联物。尽管在体外实验中较高的载荷增加了细胞杀伤效力，但在小鼠异种移植模型中，以相同抗体剂量给药时，DAR-4 和 DAR-8 制剂展现出的抗肿瘤活性相当。DAR-8 制剂的清除速率约为 DAR-4 的 3 倍，而 DAR-4 的最大耐受抗体剂量则是 DAR-8 的 2 倍。这些结果证实，针对特定的“抗体-连接子-载荷”组合存在取决于载荷的权衡关系，而非所有偶联物都存在一个通用的最佳 DAR。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

细胞摄取、药物释放与旁观者效应

主要的摄取途径始于抗体组分与其细胞表面的靶抗原结合，随后发生内吞和细胞内加工，从而释放出具有活性的细胞毒性载荷。这一过程并不意味着所有偶联物都会释放相同的化学实体，或利用相同的细胞内转运机制。例如，恩美曲妥珠单抗（T-DM1）与 HER2 的结构域 IV 结合，经历受体介导的内吞作用并在溶酶体中降解。其携带药物的分解代谢产物会破坏微管网络，导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。因此，抗原识别启动了药物递送，但细胞内加工同样是载荷发挥作用的必要环节。(fda.gov)

对于 T-DM1，抗体降解期间不可裂解连接子仍与载荷保持相连，生成由赖氨酸残基、连接子残留部分和 DM1 组成的活性分解代谢物 Lys-SMCC-DM1。释放至溶酶体腔内并不是最终的递送步骤：该代谢产物还必须进入细胞质才能作用于微管蛋白。在 2022 年的一项研究中，Ryuto Tomabechi 及其同事证明溶酶体膜蛋白 SLC46A3 可直接转运 Lys-SMCC-DM1。他们将 SLC46A3 鉴定为一种质子偶联转运体，并发现其转运活性的药理学抑制剂会削弱 T-DM1 的细胞毒性。这些实验将偶联物的降解与其活性产物跨溶酶体膜的转运区分开来；后者是一项特异性的机制要求，而非游离释放的 DM1 发生简单的被动扩散。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

当释放的载荷影响周围邻近细胞（包括极低表达或不表达靶抗原的细胞）时，就会产生旁观者效应。在针对 DS-8201a（后被称为德曲妥珠单抗）的实验中，其释放出的拓扑异构酶 I 抑制剂 DXd 穿透膜的能力远高于 Lys-SMCC-DM1。这一差异揭示了一种机制：抗原阳性细胞可作为周围抗原阴性细胞的局部细胞毒药物来源。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

2016 年，Yusuke Ogitani 及其同事将 HER2 阳性的 KPL-4 细胞与 HER2 阴性的 MDA-MB-468 细胞混合共培养进行测试。在 10 nM 浓度下作用 5 天后，DS-8201a 杀伤了这两种细胞群；而 T-DM1 及携带膜渗透性较差的 DXd 衍生物对照物虽然杀伤了 HER2 阳性细胞群，却未产生相当的旁观者杀伤。单独培养的 MDA-MB-468 细胞对完整的偶联物不敏感，这证实了混合培养体系中存在间接的载荷递送。(onlinelibrary.wiley.com)

研究人员还在小鼠体内混合接种了 HER2 阳性的 NCI-N87 细胞与带有荧光素酶标记的 HER2 阴性 MDA-MB-468 细胞。DS-8201a 降低了荧光素酶信号，表明其抑制了抗原阴性细胞群；对照物则未见此抑制效果。在对侧侧腹单独接种的 HER2 阴性肿瘤并未受到类似抑制，证实了在该模型中这一作用具有局部性。这些细胞培养和动物实验结果确立了机制层面的证据，但并不构成证明旁观者效应本身即可改善患者临床预后的临床证据。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

药代动力学与临床药理学

在临床开发阶段，检测通常针对循环系统中的多种分析物展开，而不是将抗体偶联药物视为单一的药代动力学实体。偶联抗体指携带至少一个载荷分子的抗体分子；总抗体包括偶联抗体和未偶联抗体；游离载荷则是脱离抗体的游离小分子药物。这些测量指标反映了不同的成分池：总抗体浓度无法说明其中有多少仍结合有载荷，而游离载荷则需要单独定量。美国食品药品监督管理局（FDA）2024年3月发布的行业指南建议，从首次人体试验开始就应采用经过验证的分析方法。后续若要省略某种分析物的检测，必须说明依据——例如，当抗体仅起载体作用且其浓度与偶联物高度相关时，总抗体的测定就可能不再必要。(fda.gov)

剂量-暴露量分析用于表征给药剂量与体内循环浓度的关系；暴露量-反应分析则将这些浓度与疗效和不良反应联系起来。FDA 建议在研发早期就针对不同给药剂量或方案，全面考察偶联物及相关组分的表现。不同成分对整体作用的贡献并不一定同步：若为了使某一特定患者亚群的游离载荷暴露量恢复正常而调整剂量，也可能改变偶联物的暴露量，进而影响疗效。暴露量-反应关系的分析结果既可为给药方案的选择提供支持，也可用于评估剂量调整，避免简单地假设适合某一成分的剂量就一定能使整个产品达到最优效果。(fda.gov)

肝功能和肾功能受损对不同组分的影响可能存在差异。研究人员通过群体药代动力学分析或专门的研究来评估这些影响，并重点关注载荷的消除过程以及暴露量-毒性关系。(fda.gov) 维布妥昔单抗（brentuximab vedotin）便是一个定量的典型案例。其2023年美国处方信息中描述的研究对器官功能受损患者给予了 1.2 mg/kg 的剂量。以浓度-时间曲线下面积（AUC）衡量的游离单甲基奥瑞他汀E（MMAE）暴露量，在3例重度肾功能不全（肌酐清除率低于 30 mL/min）患者中约为肾功能正常患者的2倍；轻度或中度肾功能不全则未对 MMAE 的 AUC 产生显著改变。在7例肝功能不全患者中（包含1例 Child–Pugh A 级、5例 Child–Pugh B 级和1例 Child–Pugh C 级），MMAE 的 AUC 较肝功能正常患者高出约 2.3 倍。(accessdata.fda.gov)

药物相互作用评估将载荷抑制或诱导代谢途径的能力，与其作为酶或转运蛋白底物的易感性区分开来。循环中游离载荷浓度较低可能会降低其抑制或诱导代谢酶的风险，但并不能消除其作为底物的相互作用风险：其他联用药物可能会降低载荷的清除率，而暴露量哪怕只是轻度增加也可能影响安全性。因此，体外酶和转运蛋白研究能够为是否需要开展临床相互作用试验提供参考。(fda.gov) 在维布妥昔单抗的研究中，与强效 CYP3A4 抑制剂酮康唑联用使 MMAE 的暴露量增加了约 34%，而与强效诱导剂利福平联用则使其暴露量降低了约 46%。这些结果反映的是释放出的游离载荷变化，并不代表偶联抗体的暴露量也发生了同等程度的改变。(accessdata.fda.gov)

免疫原性评估主要针对机体对抗体、偶联药物或连接子相关结构产生的免疫反应。研发中会评估抗药抗体对药代动力学、安全性和疗效的潜在影响；仅检测出抗体本身并不能判定其必然产生具有临床意义的后果。FDA 建议采用分级检测策略，并可能需要多种分析方法来确定抗体所识别的具体组分。这一区分十分重要，因为仅针对抗体骨架的检测方法可能无法检出针对偶联引入的结构所产生的免疫反应。(fda.gov)

生产与分析表征

生产过程包括抗体的生产与纯化、连接子–载荷中间体的单独制备、偶联反应以及所得产物的纯化。文献中记载的一个实例是冯·田（Feng Tian）及其同事于2014年开展的研究：他们在中国仓鼠卵巢细胞中表达了含有非天然氨基酸对乙酰苯丙氨酸的抗体，表达量超过1 g/L。抗体通过Protein A亲和色谱法和阳离子交换色谱法进行纯化。单独制备的单甲基奥瑞他汀D衍生物携带一个末端带有烷氧基胺的连接子，该连接子与工程化引入的酮基反应形成肟键。通过超滤去除残留的小分子试剂后，获得了每个抗体偶联两个药物分子、均一性极高的偶联物，报道的偶联产率在95%以上。这些结果展示了一种特定的生产策略，而非适用于所有ADC的通用标准。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

分析表征需要区分多个关键属性，这些属性无法简单归结为单一的纯度指标。鉴别关注预期的抗体、连接子–载荷结构以及共价偶联物是否存在；结合位点分布关注哪些氨基酸残基连接了药物；药物载量关注每个抗体分子上结合的载荷数量及其分布；而残留成分则包括未偶联的抗体以及游离药物或连接子–药物分子。定点合成在纯化前并不一定能消除载荷的异质性。在2024年的一项研究中，青山道彦（Michihiko Aoyama）及其同事利用疏水相互作用色谱法分离了药物抗体比（DAR）为0、1和2的制品，成功分离出DAR为2的组分。残留的小分子物质需要单独的分析方法：2016年的一项研究开发了多反应监测质谱联用液相色谱法，可对低至10 nM的游离连接子–载荷进行定量，并将其用于监测切向流过滤过程中的去除效果。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

液相色谱法与质谱法能够提供互补的分离效果和结构信息。疏水相互作用色谱法可以分离不同载药量的组分，并支持通过峰面积积分计算平均DAR。完整蛋白质量测定能够识别与所偶联载荷相符的质量增量，而抗体亚基分析则能提供更局部的结构信息。2017年，饭冢玲子（Reiko Iizuka）及其同事利用疏水相互作用色谱结合紫外检测，以及天然态分子排阻色谱–质谱联用法，评估了低、中、高载荷水平的半胱氨酸偶联ADC，两种方法得出的DAR估算结果具有可比性。他们的二维分析流程将各个疏水相互作用色谱峰转移至反相色谱中，并借助亚基质量分析来探究偶联位点。因此，仅凭平均DAR既无法确定不同载量分子的比例，也无法区分带有相同数量药物的位置异构体。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

稳定性评估必须区分抗体结构的保持与所偶联药物的保持。热学测定可以探查蛋白质的去折叠变化，而对载药量和释放出的小分子进行连续测定则可研究连接子的完整性以及载荷的脱落情况。例如，青山及其同事分别测定了热转变和连接子稳定性，追踪了在细胞培养条件下放置0、6、24、48和96小时后的DAR变化。这类实验旨在探究具体的降解机制，仅凭这些实验本身无法确立储存货架期。ICH Q5E指导原则要求在生产工艺变更后开展实时和加速稳定性对比，并指出强力破坏试验对于检测降解途径的变化可能具有重要价值。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

因此，生产工艺发生变更时需要进行可比性研究，而不能仅仅确认平均DAR是否保持不变。针对处于研究阶段的抗HER2偶联药物ARX788的一项已发表研究，通过分析对比考察了原液与制剂生产场地、处方以及剂型变更带来的影响。根据ICH Q5E，可比性评估需考量理化性质、生物学活性、杂质谱和稳定性；若质量数据足够充分且具信息量，无需额外的临床研究即可确立可比性。药代动力学桥接研究关注的则是另一个问题——即变更前后的物料在给药后是否表现出可比的体内行为；当分析证据仍存有实质性疑问时，可能需要此类研究。相似的循环暴露量无法替代对生产物料中新杂质的识别，也无法替代对其分子变异体分布变化的判定。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

临床应用与生物标志物评估

在急性髓系白血病（AML）中，吉妥珠单抗奥佐米星（gemtuzumab ozogamicin）将治疗选择与细胞表面抗原 CD33 的表达挂钩。2017年9月1日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准其用于新诊断的 CD33 阳性 AML 成人患者，以及年满2岁及以上且患有复发或难治性 CD33 阳性 AML 的患者。该批准覆盖的正是这些特定人群，而非所有 AML 患者。新诊断患者的适应症包含与诱导化疗联合使用，这表明 ADC 既可纳入多药联合方案，而不仅是作为传统细胞毒性治疗的替代物。(cancer.gov)

在乳腺癌中，德曲妥珠单抗（trastuzumab deruxtecan）的适应症由 HER2 状态、疾病范围以及既往治疗史共同界定。其于2019年12月20日在美国获得的最初加速批准，适用于既往在转移阶段接受过至少两线抗 HER2 治疗方案的不可切除或转移性 HER2 阳性乳腺癌成人患者。2022年8月5日，FDA 将批准范围扩大到既往在转移阶段接受过化疗，或在辅助化疗期间或化疗后6个月内复发的不可切除或转移性 HER2 低表达（HER2-low）乳腺癌。后一项适应症在传统 HER2 阳性范畴之外确立了符合治疗条件的人群；但这并不意味着所有 HER2 阴性乳腺癌都符合治疗条件。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

HER2 评估区分了三种不同的生物学检测维度。免疫组织化学（IHC）评估肿瘤组织中的蛋白表达；原位杂交（ISH）评估 ERBB2 基因扩增；分子检测则可识别激活性的 ERBB2 突变。这些阳性结果不能混为一谈或相互替代。在乳腺癌的治疗选择中，HER2 阳性通常定义为 IHC 3+ 或 ISH 阳性，而用于德曲妥珠单抗的 HER2 低表达范畴则是 IHC 1+ 或 IHC 2+/ISH 阴性。因此，IHC 2+ 的结果必须结合基因扩增结果才能区分患者是否符合治疗标准。仅注明“HER2 阴性”的报告无法体现低表达与其他阴性结果之间的差别。(cancer.gov)

2025年1月27日，随着德曲妥珠单抗在美国获批用于既往在转移阶段接受过一种或多种内分泌治疗后出现进展的不可切除或转移性激素受体阳性、HER2 低表达或 HER2 超低表达（HER2-ultralow）乳腺癌，极低表达水平获得了针对特定治疗的进一步定义。HER2 超低表达被明确界定为伴有细胞膜染色的 IHC 0，而非所有 IHC 0 病例。FDA 还同时批准了 Ventana PATHWAY anti-HER-2 (4B5) 检测作为该类别的伴随诊断。在入组 866 例患者且排除了既往针对晚期或转移性疾病接受过化疗的 DESTINY-Breast06 试验中，713 例 HER2 低表达患者接受德曲妥珠单抗治疗的中位无进展生存期为 13.2 个月，而接受医生选择的化疗则为 8.1 个月。该估算值描述的是 HER2 低表达人群的分析结果，而非仅针对超低表达亚组。这些定义和治疗史要求属于特定药物与特定适应症，并不适用于所有靶向 HER2 的 ADC。(fda.gov)

在肺癌中，决定治疗资格的则是另一项 HER2 检测指标。2022年8月11日，FDA 加速批准德曲妥珠单抗用于既往接受过全身治疗、经 FDA 批准的检测检出携带激活性 HER2（ERBB2）突变的不可切除或转移性非小细胞肺癌成人患者。这种基于基因突变界定的适应症不同于基于蛋白过表达或基因扩增的筛选：乳腺癌的 IHC 分类标准不能直接套用于该肺癌适应症。(fda.gov)

ADC MATCH 是一项针对晚期或转移性实体瘤的 II 期多子研究临床试验，它将生物标志物评估进一步拓展。该试验在其筛选框架中结合 RNA 与蛋白质检测，分别研究了戈沙妥珠单抗（sacituzumab govitecan）针对 Trop-2 表达、维恩妥尤单抗（enfortumab vedotin）针对 nectin-4 表达以及德曲妥珠单抗针对 HER2 表达的疗效。方案规定的入组标准包括：维恩妥尤单抗队列要求 nectin-4 IHC 2+ 或 3+，德曲妥珠单抗队列要求 HER2 IHC 2+ 或 3+ 且具备符合条件的 RNA 表达水平。这些阈值仅用于界定试验入组资格；它们既不能证明药物在所入组的各类肿瘤中均具有疗效，也不构成监管机构额外的批准适应症。(cancer.gov)

安全性与治疗窗

抗体偶联药物（ADC）的治疗窗是指既能产生抗肿瘤活性又不致引起无法耐受毒性的暴露量范围。对特定抗原的选择性识别并不代表完全的肿瘤特异性：正常细胞同样可能表达该靶点，且细胞摄取也可能独立于抗原结合而发生。此外，从偶联物中释放并进入循环的载荷构成了肿瘤外暴露的另一潜在途径。关于肺损伤的实验研究表明，肺泡巨噬细胞上 Fcγ 受体介导的抗原非依赖性摄取可能参与其中，尽管此类发现并不能代表所有 ADC 相关肺毒性的统一起制。因此，靶向递送虽能改变药物分布，但并不能为健康组织提供绝对的保护。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

安全性评估需要将给药的原型偶联物与其循环组分及降解产物区分开来。完整的 ADC 决定了偶联药物递送至何处，而游离载荷及具有药理活性的含药代谢物则可能具有不同的分布、清除途径和毒性效应。美国食品药品监督管理局（FDA）于 2024 年 3 月发布的指南要求，从首次人体试验开始就应测定 ADC 及其相关组分，并在后续的暴露-反应分析中纳入可定量的活性代谢物。仅测定总抗体浓度往往不足以代表这些暴露情况。在评估 QTc 间期延长（与心室复极延迟相关的指标）时，主要分析物通常是游离载荷和活性代谢物，而非抗体成分。(fda.gov)

因此，剂量的选择取决于抗肿瘤活性与毒性反应之间的双重关系，而非单纯追求增加对靶抗原阳性细胞的递送量。FDA 指南指出，在药物研发早期应在较宽的剂量范围内进行评估，以明确偶联物本身及其活性组分各自的贡献。循环中游离载荷的浓度较低，并不意味着其在临床上不重要：当载荷活性极高时，清除受阻导致的相对轻微浓度升高也可能危及安全性。因此，暴露-毒性分析和相互作用评估需将相关成分与偶联物整体分开考量。(fda.gov)

德曲妥珠单抗（trastuzumab deruxtecan）典型地体现了特定药物引发间质性肺病及肺炎（包括致死性事件）的风险。在 Bob T. Li 及其同事于 2021 年在线发表的 DESTINY-Lung01 试验初始报告中，91 名标准治疗耐药的转移性 HER2 突变非小细胞肺癌患者接受了每三周一次 6.4 mg/kg 的静脉注射。在中位随访 13.1 个月时，经独立裁定的药物相关间质性肺病发生率达 26%，并导致 2 例死亡。3 级及以上药物相关不良事件发生率为 46%，其中该严重程度的中性粒细胞减少症报告率为 19%。这些数据仅反映该特定人群、给药方案及分析结果，并不能作为德曲妥珠单抗所有适应症或 ADC 类药物普遍发生率的估算依据。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

免疫原性是安全性的另一个因药物而异的维度。机体的免疫应答可能会识别抗体、连接子或偶联的载荷，由此产生的抗药抗体可能会影响药物的暴露量、安全性或疗效。FDA 提出了一套分层检测策略，可能需要多种检测手段来明确被识别的具体组分。检测结果呈阳性本身并不直接等同于临床危害，其解读取决于其与药代动力学改变及所观察到的临床结局之间的关系。同理，为某种 ADC 所确立的不良事件特征和暴露-毒性关系，不能简单套用于另一种 ADC，即使两者针对相同靶点或使用同类载荷亦是如此。(fda.gov)

耐药性与生物学局限性

原发性无应答（或称内在耐药）是指治疗前即存在的对药物不敏感；获得性耐药则是指在初始产生治疗应答后敏感性丧失。实验模型通过对比未经处理的天然不敏感细胞、敏感亲本细胞以及在 ADC 暴露下筛选出的衍生耐药细胞来区分这两种情况。在 2018 年的一项研究中，Krista Kinneer 及其同事利用不可裂解偶联物和曲妥珠单抗-emtansine（T-DM1）耐药模型（包括人源肿瘤异种移植模型）对这两种耐药模式展开了研究。这些模型表明，除靶标表达受限外，细胞内药物处理代谢过程出现故障也是导致耐药的重要机制。即使在不同的乳腺癌细胞系之间，耐药机制也并不一致：另一项 2018 年的研究发现，耐药的 KPL-4 细胞表现为 HER2 表达减少和 MDR1 药物外排活性增加，而在耐药的 BT-474M1 细胞中，SLC46A3 的缺失和 PTEN 缺陷则是主要诱因。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

抗原表达的异质性限制了药物的递送效果，因为同一肿瘤内的不同细胞在结合并内吞靶向偶联物的能力上可能存在差异。当释放出的有效载荷穿过细胞膜时，旁观者杀伤效应可以在一定程度上绕过这一限制，但其在空间上的作用范围有限。2016 年，Yusuke Ogitani 及其同事证实，DS-8201a（后定名为曲妥珠单抗德鲁替康）在共培养体系中既能杀死 HER2 阳性的 KPL-4 细胞，也能杀死邻近的 HER2 阴性 MDA-MB-468 细胞；而 T-DM1 则未能产生类似的旁观者杀伤效应。混合细胞异种移植模型同样显示出对 HER2 阴性细胞群的抑制作用。然而，移植在同一小鼠对侧的 HER2 阴性肿瘤却未受到抑制。这些实验表明，旁观者效应只能局部弥补表达异质性带来的缺陷，但无法消除对可及的靶标阳性细胞的需求，也不能确保有效载荷在相互分离的各个肿瘤病灶中均能实现有效递送。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

溶酶体转运蛋白 SLC46A3 的缺失，为药物内吞后发生的特异性耐药机制提供了一个范例。Kinneer 及其同事筛选了 43 种溶酶体膜相关基因的表达情况，并使用靶向 EPHA2、HER2 和 BCMA 的偶联物测试了它们的功能依赖性。SLC46A3 的缺失降低了携带美坦新类微管抑制剂 DM1 或具有不同细胞毒性机制的吡咯并并二氮杂䓬二聚体 SG3376 的不可裂解 ADC 的活性。基因失活与强行表达实验证实了两者之间的因果关系，而非单纯的相关性。研究人员还报告称，在耐药细胞中重新表达 SLC46A3 可恢复其敏感性。他们在 2018 年的一份会议报告中描述了一例具有 T-DM1 获得性耐药的人源乳腺癌异种移植模型，其 SLC46A3 的表达水平比敏感亲本模型低 92%；这属于该特定模型的测量结果，不能直接推算为患者群体中的耐药发生率。(aacrjournals.org)

这里的关键瓶颈在于含有活性药物的分解代谢产物能否从溶酶体中逃逸，而不仅仅取决于抗体的结合能力。Ryuto Tomabechi 及其同事于 2022 年证实，SLC46A3 可直接转运 T-DM1 的主要分解代谢产物 Lys-SMCC-DM1，且在实验中抑制该转运蛋白会减弱 T-DM1 的细胞毒性。因此，抗原的成功识别与内吞并不必然能转化为胞质内足够的活性药物暴露。这一机制要求不能一概而论地套用到其他 ADC 上：在 Kinneer 的实验中，改变 SLC46A3 的表达并未改变携带不可裂解 MMAF 或可裂解吡咯并并二氮杂䓬连接子-载荷 SG3249 的偶联物的活性。由此可见，无论是共有相同抗原还是同属不可裂解偶联物，都不能直接推定存在相同的耐药机制；释放出的化学实体分子形式及其细胞内转运要求也必须相匹配。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

实验评估与研究方向

基于细胞的结合试验用于检验偶联是否保留了抗体对其靶抗原的识别能力，而浓度-效应细胞毒性实验则测定由此引起的细胞活率下降；仅凭结合能力并不能证明能有效递送有效载荷。在高抗原表达和低抗原表达细胞系之间的对比能够评估依赖于表达水平的活性。共培养实验探讨的则是另一个问题：表达靶标的细胞能否促成对邻近靶标阴性细胞的杀伤。小鼠体内的人类肿瘤异种移植物可在整个动物暴露水平下测量肿瘤的生长或消退，而药代动力学研究则评估其在血液循环中的留存时间及偶联物的稳定性。这些终点指标互为补充：肿瘤消退本身并不能确定究竟是哪种分子修饰改善了递送效果，也无法区分是暴露量增加还是细胞效力提高所致。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

定点偶联技术允许对偶联化学策略和结合位点进行受控对比。2014年，田丰（Feng Tian）及其同事将非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸整合到抗HER2和抗5T4抗体中，随后通过肟键连接了羟胺功能化的单甲基阿司他丁D（monomethyl auristatin D）。在啮齿动物研究中，选定的不可裂解偶联物与半胱氨酸偶联的对照物相比，表现出更优的活性和药代动力学稳定性；而对于蛋白酶可裂解接头，偶联位点则会影响稳定性。在一项大鼠单次给药研究中，一种抗HER2构建体在高达90 mg/kg的剂量下仍具有良好的耐受性。这些发现均受限于特定的构建体和模型，并不等同于在人体中具有治疗优势的证据。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

工程化改造的结合构型同样需要对机制、暴露量和耐受性进行分别测试。MEDI4276将识别两个HER2表位的四价双互补位抗体与微管溶素（tubulysin）有效载荷相结合，旨在促进受体聚集和内吞。其首次人体I期临床研究治疗了47名晚期HER2阳性乳腺癌或胃癌患者。研究人员报告了1例完全缓解和2例部分缓解（均见于乳腺癌患者），但也观察到了剂量限制性肝功能异常；在0.9 mg/kg剂量下已超过最大耐受剂量。临床报告无法明确将毒性归因于有效载荷、结合构架、偶联化学还是三者的联合作用。因此，增加结构复杂性仍是一个实验变量，而非已被证实的临床优势。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

定量建模将共培养实验拓展到了单一终点活率测定之外。2016年，Aman P. Singh、Sharad Sharma和Dhaval K. Shah研究了一种曲妥珠单抗-vc-MMAE研究用偶联物，以GFP标记的MCF7细胞作为抗原阴性细胞群，以N87、BT474或SKBR3细胞作为HER2表达细胞群。旁观者杀伤效应随着抗原阳性细胞比例及其靶标表达水平的升高而增强，但仅在可测量的滞后时间之后才会出现。随着抗原阳性细胞群的减少，该效应也可能减弱。他们的药效学模型结合了针对两种细胞群的独立细胞分布模型，将混合物组成与杀伤的时间进程及程度关联起来。这种建模描绘了特定的实验体系，但并不能证明相同的参数同样适用于具有空间组织结构的人类肿瘤。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

基于生物标志物指导的临床研究检验了另一层证据链：分子层面的筛选是否能识别出产生应答的患者。II期ADC MATCH方案首先筛选晚期或转移性实体瘤的靶标RNA表达，随后通过免疫组织化学确认靶蛋白。治疗队列将Trop-2与戈沙妥珠单抗（sacituzumab govitecan）匹配，将nectin-4与恩诺单抗（enfortumab vedotin）匹配，将HER2与德曲妥珠单抗（trastuzumab deruxtecan）匹配。研究目标包括RNA-蛋白质表达一致性及客观缓解率；治疗前与治疗中的配对活组织检查为生物学分析提供支持。这些试验方案定义的分配属于研究入组标准，而非独立的监管审批适应症。(cancer.gov)

吉妥珠单抗奥佐米星（gemtuzumab ozogamicin）体现了为什么临床活性和初步批准并不能消除对确证性证据的需求。在2000年5月17日获得美国加速批准后，其确证性试验未能证实临床获益并引发了安全性担忧，导致其于2010年撤出美国市场。2017年9月1日重新获批则基于支持调整给药剂量（包括更低的分次给药方案）的额外临床证据。它的历史表明，给药剂量、给药方案、联合治疗方案及患者人群都是证据链中不可或缺的组成部分，而不能仅凭临床前活性或靶标表达来推断这些细节。(accessdata.fda.gov)

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