DNA连接酶是一种酶，通过在脱氧核糖核酸的糖—磷酸骨架中形成磷酸二酯键，将相邻的末端连接起来。其特征性反应是将3′-羟基与5′-磷酸基连接，恢复断裂链的连续性。DNA连接酶参与DNA复制、DNA修复和重组，纯化的连接酶也是实验室组装DNA的重要工具。它们封合已有的DNA末端，而不是利用单个核苷酸合成新链。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)
底物与反应机制
细胞内的一种典型底物是切口：双链DNA中的一条链发生中断，但连接处并不缺失核苷酸。互补链使两个末端保持对齐。因此，切口不同于缺口；对于缺口，必须先补上缺失的DNA，才能进行常规的切口封合。当末端处于适当位置时，某些连接酶也能连接彼此分离的双链DNA片段。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)
连接反应分为三个化学步骤：
- 酶的腺苷酸化。 一个AMP基团以共价方式连接到连接酶中一个保守的赖氨酸残基上。
- DNA的腺苷酸化。 AMP从酶转移到DNA的5′-磷酸基上，形成活化的DNA—腺苷酸中间体。
- 链的封合。 相邻的3′-羟基进攻活化的磷酸基，形成磷酸二酯键并释放AMP。
这一反应序列将DNA末端的活化与最终共价键的形成偶联起来。反应需要一种核苷酸辅因子和一种二价金属离子，通常是镁离子，后者有助于催化反应的进行。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)
这一反应不同于DNA聚合酶催化的反应。聚合酶通过掺入核苷酸来延长DNA链，而连接酶则连接已经存在的末端。因此，DNA合成与连接承担着互补的任务：合成提供序列，连接则使骨架恢复完整的连续性。(nature.com)
按辅因子分类及其分布
DNA连接酶通常分为ATP依赖型和NAD依赖型。ATP依赖型酶从三磷酸腺苷获取腺苷酸基团，并在酶活化过程中释放焦磷酸。NAD依赖型酶使用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，并释放烟酰胺单核苷酸。随后，两类酶都通过DNA腺苷酸化和链封合完成反应。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)
哺乳动物的连接酶均为ATP依赖型。许多细菌中承担复制功能的主要连接酶属于NAD依赖型，但这种分类并不意味着细菌与真核生物之间存在绝对的界限：一些细菌除编码NAD依赖型连接酶外，还编码ATP依赖型连接酶。实验室试剂也包含这两类酶，它们具有不同的底物偏好和适用条件。(nature.com)
分子结构
DNA连接酶是蛋白质，其催化区域结合核苷酸辅因子，并使DNA末端处于适合反应的位置。除保守的催化结构外，它们还具有识别DNA或与其他蛋白质相互作用的结构域。结构研究表明，连接过程涉及显著的结构域运动，而非依靠固定不变的活性位点构象。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)
X射线晶体学研究揭示，人连接酶I能够完全环抱带有切口的DNA。它的DNA结合结构域、腺苷酸化结构域和寡核苷酸结合折叠结构域在底物周围形成一个环，使DNA双链发生变形，从而暴露断裂末端并将其定位。人连接酶IV的结构显示出开放和闭合的中间状态，说明结构域排列的变化如何伴随催化过程的不同阶段。(nature.com)
在哺乳动物细胞中的功能
哺乳动物细胞中有三种主要的ATP依赖型DNA连接酶，通常分别称为I、III和IV。它们的作用取决于细胞内定位、相互作用的蛋白质，以及所参与的DNA加工途径。(nature.com)
DNA连接酶I由LIG1基因编码，在后随链复制过程中连接冈崎片段。它也参与重组和碱基切除修复。在复制过程中，片段末端先经过加工，形成可封合的连接部位，再由连接反应完成片段间的连接。(nature.com)
DNA连接酶III具有细胞核型和线粒体型。其细胞核型与修复支架蛋白XRCC1相互作用，而线粒体型的活性支持线粒体内DNA的维持。哺乳动物细胞中的遗传学实验表明，连接酶III对线粒体DNA的维持至关重要，但并非在所有情况下都是XRCC1依赖性核内修复所必不可少的；在所测试的系统中，其他连接酶的活性也能支持这种修复。(nature.com)
DNA连接酶IV与XRCC4协同作用，参与修复DNA双链断裂的经典非同源末端连接途径。它也是V(D)J重组所必需的；这一DNA重排过程负责组装抗原受体基因。连接酶IV在一个更大的复合物中承担连接步骤，该复合物负责识别和加工断裂的DNA末端。(ncbi.nlm.nih.gov)
实验室应用
DNA连接酶可用于构建重组DNA，包括将DNA片段插入质粒载体。源自T4噬菌体的T4 DNA连接酶得到广泛应用，因为它既能封合切口，也能连接具有黏性末端或平末端的双链DNA。黏性末端具有互补的单链突出端，而平末端没有这类突出端。连接反应要求末端具备适当的化学基团，包括每个待封合的连接部位都要有5′-磷酸基。(neb.com)
不同连接酶不能随意互换。例如，耐热的Taq DNA连接酶使用NAD，能够连接在互补模板上对齐的相邻DNA链。它能区分并排斥配对错误的连接部位，因此可用于基于连接反应的序列变异检测。连接效率和特异性取决于酶、末端结构、缓冲液及反应温度；适合封合模板引导下的切口的酶，并不一定能高效连接游离的DNA片段。(intl.neb.com)